矮牵牛花型突变体的形态结构及其分子基础研究

论文摘要

近十多年来，通过对模式植物拟南芥、金鱼草和矮牵牛等花发育突变体的不断研究，科学家们对花发育提出了不同的模型。然而，对花发育的认识因为突变体的数量及类型有限而受到限制，对有关花瓣数目增多以及花瓣花药化的研究还很不深入。对矮牵牛的研究，到目前为止，发现的花器官自然突变体不多，局限于dol、blind、gb与phoenix等，而且在后来的研究中一直被人们用其来研究基因的互作。人们对矮牵牛的部分花发育相关的MADS-BOX基因克隆并通过转基因方法获得一些人工花器官突变体的研究，丰富了花发育的理论。另外，人们虽然对矮牵牛的B类基因研究较多，但很少涉及到花瓣增多的研究。矮牵牛既是一种研究花发育的模式植物，又是一种在园林中广泛应用的花卉植物，对其花器官突变体的研究以及通过转基因获得变异植株，无论对植物花器官发育研究还是对植物育种均有重要意义。本研究以重瓣矮牵牛、新发现的blind-like矮牵牛花器官突变体为切入点做了部分研究，获得了以下主要结果：1．通过对许多矮牵牛种质资源进行连续的自交，从一自交系中发现了blind-like突变体植株，并对该植株进行组培及扦插繁殖，确认该突变体性状保持稳定，主要表现为花数增多，花冠退化，花瓣顶端出现花药状结构。通过体细胞突变体诱导和染色体加倍等方法，得到了大量的与重瓣性相关的变异植株，重瓣矮牵牛具有无限增殖的雄蕊与增多的花瓣，并且对重瓣矮牵牛叶片诱导的愈伤组织进行长期离体培养获得了大量遗传变异植株。2．对单瓣、blind-like突变体和重瓣矮牵牛解剖结构及扫描电镜的比较观察分析表明，它们的雄蕊与花瓣之间相互具有对方的组织器官，重瓣起源与别的物种存在差异，发现重瓣矮牵牛的内层部分花瓣明显具有雄蕊特征。blind-like突变体的花瓣上的花药化结构在雄蕊原基的形成时就已经出现．3．构建了重瓣矮牵牛花发育各个时期的均一化cDNA文库，通过克隆与初步分析了PHCYP51基因与及其它基因检测了文库质量。构建了单重瓣花发育的cDNA差减文库，完成了初步筛选并得到了一批差异cDNA片段。利用文库与合成第一链cDNA，重复的通过PCR克隆了10多个重瓣矮牵牛MADS-BOX基因的读码框，并进行了与单瓣的比较分析，表明了单重瓣之间的部分MADS-BOX基因内读码框碱基存在非同义突变。4．对blind-like突变体和重瓣矮牵牛进行了初步的遗传分析，blind-like突变体可能是由转座子插入引起突变，而矮牵牛的单瓣为隐性形状。利用RT-PCR对矮牵牛多个MADS-BOX基因在单瓣、重瓣与blind-like突变体矮牵牛各个花器官上的表达特性的研究结果表明，部分基因在单瓣、重瓣与blind-like突变体矮牵牛各个花器官上的表达模式在花器官之间存在差异。以PHAP2A与PMADS3为探针对花器官组织原位杂交表明，PHAP2A在重瓣的表达模式跟单瓣之间没差异，PMADS3仅在重瓣矮牵牛的内轮花瓣、雄蕊及心皮中表达，而在blind-like突变体上其表达则扩展到每一轮花器官。5．对由cDNA文库与差减文库克隆到的cDNA大片段和部分MADS-BOX基因进行了正义与RNAi的植物表达载体构建，部分已经转化到矮牵牛、烟草植株中，并在某些转化体上改变了花型。其中花瓣增多的烟草转基因植株是由S3基因的cDNA片段以RNAi的形式单转化的引起的，在一些转化植株中，有的花药形状发生变化，有的雄蕊完全瓣化，看到的均为花瓣，而且对烟草植株的结实具有比较明显的影响。对这些转基因植株的分子分析正在进行中根据以上实验结果，按照blind-like突变体与重瓣矮牵牛表型与基因表达的相似性，我们初步推测出以下结论，blind-like突变体的形成是矮牵牛C类基因在第二轮花器官异位表达所致；鉴于从矮牵牛上分离的基因以RNAi作用的形式导入烟草得到大部分转基因烟草植株雄蕊瓣化、花瓣增多等表型的现象，结合对重瓣矮牵牛的解剖与MADS-BOX的表达分析，重瓣矮牵牛的形成有两方面原因：一方面某类基因的表达或失活使得雄蕊增多，另一方面部分基因功能的缺失，使雄蕊发生瓣化。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1.1 植物花的形成与发育
• 1.1.1 花发育的时间性问题
• 1.1.1.1 开花抑制途径
• 1.1.1.2 春化促进途径
• 1.1.1.3 自主促进途径
• 1.1.1.4 碳水化合物诱导途径
• 1.1.1.5 赤霉素促进途径
• 1.1.1.6 光周期诱导途径
• 1.1.2 花分生组织特征基因及其作用
• 1.1.3 MADS-box基因与花器官发育的模型
• 1.1.3.1 植物MADS-box基因概述
• 1.1.3.2 花器官发育的模型及其修正
• 1.1.3.3 花器官突变体类型与同源异型基因
• 1.1.4 花发育的基因调控网络
• 1.2 植物基因的克隆方法
• 1.2.1 功能克隆
• 1.2.2 转座子或T-DNA标签技术
• 1.2.3 同源序列克隆基因
• 1.2.4 图位克隆
• 1.2.5 表达序列标签（EST）技术
• 1.2.6 基因陷阱（gene trap）
• 1.2.7 抑制消减杂交法
• 1.3 基因沉默技术研究进展
• 1.3.1 共抑制与反义RNA技术
• 1.3.2 RNAi技术
• 1.3.3 MiRNA调控
• 1.3.4 RNAi技术与基因功能的研究
• 1.4 矮牵牛花器官特性基因的克隆及功能分析
• 1.4.1 矮牵牛花的结构特点与几个自然突变体
• 1.4.2 矮牵牛花器官特性基因的克隆及功能分析
• 1.4.3 矮牵牛花器官特性基因的表达分析
• 1.5 花发育相关基因在植物性状改良中的应用
• 1.5.1 性状在物种内及物种间转移
• 1.5.2 开花时间的调节
• 1.5.3 花型的改变
• 1.5.4 创造不育植株
• 1.6 本研究的目的、意义和内容
• 第二章 矮牵牛种质资源创新及blind-like突变体、重瓣矮牵牛变异植株的获得及其表型分析
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 植物材料
• 2.2.2 实验与方法
• 2.2.2.1 变异植株的繁殖与表型分析
• 2.2.2.2 长期离体培养获得重瓣变异植株
• 2.2.2.3 秋水仙素诱导获取重瓣四倍体及多倍体
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 矮牵牛Blind-like花器官突变体的表型特征
• 2.3.2 重瓣矮牵牛的表型特征
• 2.3.3 重瓣矮牵牛的长期离体培养与变异的再生植株
• 2.3.3.1 愈伤组织诱导
• 2.3.3.2 愈伤组织连续频繁继代
• 2.3.3.3 愈伤组织的分化与植株再生
• 2.3.3.4 再生芽的复壮
• 2.3.3.5 再生植株的ISSR分析
• 2.3.4 重瓣矮牵牛的四倍体及多倍体
• 2.3.4.1 秋水仙素对幼苗的作用
• 2.3.4.2 变异植株的主要形态与气孔的变化
• 2.3.4.3 变异植株的细胞染色体与DNA含量的变化与倍性确定
• 2.3.4.4 嵌合体分离、杂交及F1代不同植株倍性的确定和表型分析
• 2.4 讨论
• 2.4.1 Blind-like突变体与矮牵牛blind突变体的比较分析
• 2.4.2 长期离体培养重瓣矮牵牛获取变异植株的可能
• 2.4.3 重瓣矮牵牛多倍体对研究与育种的价值
• 第三章 矮牵牛blind-like突变体与重瓣矮牵牛解剖结构及扫描电镜观察与比较分析
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 植物材料
• 3.2.2 实验方法
• 3.2.2.1 石蜡切片
• 3.2.2.2 扫描电镜观察
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 各种类型矮牵牛的解剖结构特征
• 3.3.1.1 野生型矮牵牛的花发育与部分花器官的解剖结构
• 3.3.1.2 Blind-like矮牵牛的花发育与部分花器官的解剖结构
• 3.3.1.3 重瓣矮牵牛的花器官的解剖结构及其与重瓣梅花的比较
• 3.3.2 野生型、blind-like和重瓣矮牵牛部分花器官扫描电镜观察
• 3.4 讨论
• 3.4.1 blind-like突变体的可能成因
• 3.4.2 矮牵牛重瓣的可能成因
• 3.4.3 研究blind-like和重瓣矮牵牛的重要意义
• 第四章 重瓣矮牵牛的均一化与差减文库的构建、单重瓣部分MADS-BOX基因序列比较及相关基因全长的克隆分析
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 植物材料、菌株、质粒、试剂
• 4.2.2 实验方法
• 4.2.2.1 重瓣矮牵牛的花发育时期的均一化cDNA文库的构建
• 4.2.2.2 用RACE扩增基因全长及其序列分析
• 4.2.2.3 单重瓣差异表达的差减cDNA文库的构建
• 4.2.2.4 重瓣矮牵牛MADS-BOX基因的ORF的扩增、比较
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 文库构建与PHCYP51基因的克隆
• 4.3.1.1 总RNA的提取结果
• 4.3.1.2 双链cDNA合成与均一化
• 4.3.1.3 外源插入片段的检测
• 4.3.1.4 矮牵牛PHCYP51基因的全长克隆与分析
• 4.3.1.5 PHCYP51基因序列初步分析
• 4.3.2 单重瓣差减文库的构建与初步筛选
• 4.3.2.1 正向和反向差减文库建立
• 4.3.2.2 正向和反向差减文库中克隆的差异筛选
• 4.3.3 单重瓣部分MADS-BOX基因编码区的差异比较
• 4.4 讨论
• 4.4.1 cDNA文库、PHCYP51基因与单重瓣差减文库
• 4.4.2 矮牵牛单重瓣部分MADS-BOX基因的差异
• 第五章 矮牵牛blind-like突变体与重瓣矮牵牛的遗传及部分MADS-BOX基因表达分析
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 植物材料、菌株、质粒、试剂
• 5.2.2 实验方法
• 5.2.2.1 遗传分析群体的建立与分析
• 5.2.2.2 RT-PCR及原位杂交分析
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 重瓣矮牵牛不同后代性状分离结果统计
• 5.3.2 blind-like突变体不同后代性状分离结果统计
• 5.3.3 blind-like与重瓣矮牵牛部分基因的RT-PCR表达模式
• 5.3.4 PHAP2A、PMADS3在blind-like与重瓣矮牵牛花上的组织原位表达模式
• 5.4 讨论
• 5.4.1 对重瓣矮牵牛遗传基础的认识
• 5.4.2 对Blind-like突变体遗传基础的认识
• 5.4.3 对重瓣、Blind-like突变体矮牵牛的进一步分析
• 第六章 矮牵牛MADS-box相关基因的植物表达载体构建,转化及突变体的表型分析
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 植物材料、菌株、质粒、试剂
• 6.2.2 实验方法
• 6.2.3 基因的植物表达载体构建
• 6.2.3.1 S3基因相关的植物表达载体构建
• 6.2.3.2 FBP1与其它部分基因植物表达载体构建
• 6.3 结果
• 6.3.1 四种植物表达载体物理图谱
• 6.3.2 烟草与矮牵牛遗传转化
• 6.3.3 部分转基因植株的PCR检测
• 6.3.4 转基因植株的斑点杂交检测
• 6.3.5 转基因植株突变体的表型分析
• 6.3.5.1 植株转基因对花型的影响
• 6.3.5.2 转基因植株对花药形状、开裂的影响
• 6.3.5.3 转基因植株强表现型对植株结果的影响
• 6.3.6 转基因植株强、弱表现型植株花药的扫描电镜观察
• 6.4 讨论
• 6.4.1 转基因的检测及稳定性
• 6.4.2 与前人报道的烟草重瓣及同属的矮牵牛重瓣的比较
• 6.4.3 RNAi对内源基因的沉默现象
• 第七章 讨论与展望
• 7.1 讨论
• 7.1.1 重瓣矮牵牛、blind-like突变体与转基因瓣化烟草
• 7.1.2 关于花发育与花器官同源异型转变的思考
• 7.1.3 矮牵牛突变体及其相关研究的理论与育种意义
• 7.2 实验展望
• 参考文献
• 博士在读期间发表文章情况
• 致谢
• 附录1:The bssic plasmids used for molecular manipulation
• 附录2:Trizol protocol for total RNA isolation
• 附录3:Protocol for purification of mRNA from total RNA
• 附录4:Reverse Transcription
• 附录5:LD-PCR
• 附录6:RT-PCR or common PCR
• 附录7:BP recombination
• 附录8:Preparation of Plasmid DNA:Minipreparation
• 附录9:Reverse Northern hybridization and dot hybridization
• 附录10:In situ hybridation
• 附录11:Preparation of Competent E.coli Using Calcium Chloride
• 附录12:The DNA Extraction Kit
• 附录13:Enzyme digestion reaction
• 附录14:Lingation reaction
• 附录15:Transformation of Competent E.coli
• 附录16:Preparation and transformation of Competent LBA4404
• 附录17:Agrobacterium-mediated transformation
• 附录18:Plant genomic DNA extraction protocol
• 附录19:克隆得到的10个MADS-BOX基因或其等位基因的ORF框核苷酸序列
• 附录20:在S3基因的表达载体构建中,所用的带酶切位点的引物
• 附录21::登记基因信息