论文摘要
[背景与目的]：白血病干细胞（Leukemia stem Cells, LSC）和正常造血干细胞（Hematopoietic Stem Cells, HSC）间的竞争与失衡伴随着白血病病程发展的全程,是决定治疗转归的关键。最新研究提示PI3K/PTEN/AKT/mTOR通路可能是纠正两者间失衡的理想干预靶点。尽管目前己发现两代mTOR复合物抑制剂,但其在临床应用中的效果并不理想。本研究应用细胞印迹高通量筛选技术,寻找mTOR复合物2特异性抑制剂。并初步探讨化合物Z1选择性降解部分混合谱系白血病（Mixed Lineage Leukemia,MLL）细胞中Rictor蛋白的分子机制,为MLL白血病的基因靶向治疗提供一定的理论基础。然而Rictor在MLL白血病中究竟扮演着什么样的角色呢?于是我们一方面探讨Rictor分子在MLL白血病细胞集落形成能力、增殖和凋亡等方面所起的作用；一方面体内研究Rictor分子在MLL白血病发病和维持中所起的作用。[方法]：1.高通量筛选技术寻找mTOR复合物2特异性抑制剂：采用细胞印迹高通量筛选（Cytoblot High Throughput Assay）技术,从华北制药集团新药研发中心小分子单体化合物文库中筛选mTOR复合物2特异性抑制剂,并进一步运用Western免疫印记法,初步验证筛选得到的小分子化合物对各种白血病细胞系中的mTOR复合物关键组分蛋白的抑制作用。2.化合物Z1降解Rictor蛋白分子机制的初步探讨：以THP-1细胞作为Rictor降解机制研究的模型细胞,Western免疫印迹技术检测蛋白合成抑制剂放线菌酮（Cycloheximide, CHX）和Z1联合蛋白酶体抑制剂MG-132分别作用该细胞后Rictor蛋白表达水平的变化；荧光素酶-蛋白酶体活性分析技术（Luciferase-Proteasome-Glo Cell-Based Assay）检测Z1处理后细胞蛋白酶体活性变化；构建体外泛素化模型,检测Rictor蛋白泛素化修饰情况。3. Rictor分子对MLL白血病细胞作用的体外实验研究：首先运用Rictor-shRNA慢病毒反义封闭技术对MLL白血病细胞、非MLL白血病细胞及正常细胞中的Rictor分子加以反义封闭；然后利用该系统所带GFP经流式分选获得GFP-Rictor-RNAi细胞；经流式细胞术、细胞免疫荧光术及Western免疫印迹法鉴定封闭效应后,通过甲基纤维素集落形成实验检测Rictor反义封闭对各种细胞集落形成能力的差别,并同时运用流式细胞术检测相应细胞增殖和凋亡情况的差别。4. Rictor分子对MLL白血病发病和维持影响的初步研究：建立白血病人源化NOD/SCID免疫缺陷小鼠模型；动态监测小鼠外周血hCD45+细胞及hCD45/GFP双阳性细胞比例,对异种移植是否成功加以评估,同时也对Rictor-RNAi组与其他组间抑制率进行比较；在实验的终点,比较各组小鼠的整体观以及肝脏、脾脏等器官；流式细胞仪分析各组骨髓、肝脏和脾脏hCD45/GFP双阳性细胞比例,并比较其差别；免疫组织化学染色技术检测各组肝脏、脾脏、肾脏和肺hCD45阳性细胞表达情况；RT-PCR技术检测移植小鼠外周血单个核细胞MLL融合基因表达；绘制生存曲线,评估各组小鼠生存期差别。[结果]：1.Z1化合物对部分MLL白血病细胞系中的mTOR复合物2保守组分Rictor蛋白有选择性抑制作用,而其他白血病细胞系经Z1化合物作用后仅出现mTOR复合物2下游分子磷酸化水平（如p-AKT ser473）的下降。2.用Western免疫印迹技术检测到,经10nmol/L CHX处理后不同时间点的THP-1细胞中Rictor蛋白均无降解现象；MG-132可以逆转Z1引起的THP-1细胞中Rictor蛋白的降解；THP-1细胞中蛋白酶体活性被Z1所抑制；GST标签的Rictor片段蛋白可以在体外被经Z1作用后的THP-1细胞粗提液（S100）泛素化。3.经流式细胞术鉴定,分选后各组GFP阳性细胞均在90%以上,同时细胞免疫荧光术及Western免疫印迹法均证实Rictor蛋白封闭效应明显；MLL白血病细胞Rictor-RNAi组集落形成能力明显低于NC-RNAi组（P<0.001）,而非MLL白血病细胞和正常细胞中两组间差别均没有统计学意义（P>0.05）；同时,MLL白血病细胞Rictor-RNAi组增殖能力也明显低于NC-RNAi组（P<0.01）,在MLL白血病细胞Rictor-RNAi组中MG-132失去逆转Z1引起的细胞凋亡的作用,这些现象在其他类型的细胞中均没有出现。4.动态监测THP-1异种移植模型小鼠外周血hCD45+细胞随着时间的延长而比例增加,说明建模成功；THP-1感染Rictor-RNAi组模型鼠外周血hCD45+细胞比例与THP-1未感染慢病毒组以及THP-1感染NC-GFP组模型鼠外周血hCD45+细胞比例在为期9周的动态检测期均无明显差别（P>0.05）,但THP-1感染Rictor-RNAi组模型鼠外周血hCD45/GFP双阳性细胞比例从第7周开始就显著低于NC-GFP对照组（P<0.01）;实验监测期的终点,可见Rictor-RNAi组模型鼠整体状况好于NC-GFP对照组,且肝脏瘤结节数目体积均小于对照组；Rictor-RNAi组模型鼠肝脏、脾脏和骨髓中hCD45/GFP双阳性细胞比例均显著低于NC-GFP对照组（P<0.01）；Kaplan-Meier曲线生存分析显示Rictor-RNAi组模型鼠生存时间长于对照组（P=0.033）。[结论]1.运用细胞印迹高通量筛选技术,从小分子单体化合物文库初步筛选并得到一种能够选择性降解部分MLL白血病细胞系中mTOR复合物2保守组分Rictor蛋白的特异性小分子化合物,为研究MLL白血病的靶向治疗提供了新的分子靶点。2. Rictor作为一种高度保守蛋白在一般情况下是很稳定的,但Z1可引起THP-1细胞中Rictor蛋白通过泛素-蛋白酶体途径（ubiquitin-proteasome pathway, UPP）降解,这种降解作用很可能是通过Z1活化该途径的E3泛素连接酶而实现的,与蛋白酶体自身活性无关。3. Rictor分子在MLL白血病细胞集落形成能力、增殖和凋亡调控等方面起着重要的作用,提示它可能是MLL白血病靶向治疗中的一个关键靶基因。4. Rictor分子是MLL白血病发病和维持所必须的。