河豚鱼皮胶原蛋白肽的制备及其抗氧化性的研究

论文摘要

河豚鱼（Takifugu rubripes）营养丰富,是一种很有经济价值的鱼类。其鱼皮中富含胶原蛋白,是制备生物活性肽的良好原料。本课题采用热水法提取河豚鱼皮中的胶原蛋白。选择酶解能力最强的木瓜蛋白酶酶解胶原蛋白获取胶原蛋白肽。通过单因素实验和正交实验,以酶解产物的多肽得率和羟自由基清除活性为指标,确定最佳酶解条件。在最佳条件下提取的胶原蛋白肽通过超滤技术分离成不同分子量范围的三个组分：3～10kDa、1～3kDa、1kDa以下。采用Fenton体系,DPPH体系,邻苯三酚自氧化体系和还原体系评价各个组分抗氧化活性。将抗氧化活性较高的组分采用离子交换层析、凝胶过滤层析和高效液相色谱分离纯化,制备抗氧化胶原蛋白肽。实验结果表明,河豚鱼皮胶原蛋白肽的最佳提取酶是木瓜蛋白酶,最佳酶解条件为：温度45℃,时间2h,酶加量5000U/g, pH6.5,底物浓度33.6mg/100mL。在此条件下,水解产物的多肽得率为34.76%,羟自由基清除率为67.54%。不同分子量范围的三个河豚鱼皮胶原蛋白肽组分均具有较强的抗氧化活性,其清除羟基自由的能力最强,清除DPPH的能力次之,清除超氧阴离子的能力和还原能力相对较差,并且分子量越小其抗氧化能力越强。分子量在1～3kDa范围内的河豚鱼皮胶原蛋白肽组分经DEAE Sepharose CL-6B阴离子交换柱分离后得到组分A和B；组分A和B分别经过Sephadex G-25凝胶过滤柱分离后得到组分A-Ⅰ、A-Ⅱ和B-1、B-Ⅱ;组分A-Ⅱ和B-Ⅱ经HPLC分离后分别得到6个和5个纯化肽。实验结果表明,河豚鱼皮胶原蛋白肽经分离纯化后,其抗氧化活性降低,且分离产物的分子量越小其抗氧化能力越强。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 胶原蛋白肽的提取
• 1.2 胶原蛋白肽的生物活性
• 1.2.1 降血压活性肽的研究
• 1.2.2 抗氧化活性肽的研究
• 1.2.3 抗肿瘤以及其它活性的研究
• 1.3 胶原蛋白肽的分离纯化及结构鉴定
• 1.4 胶原蛋白肽的原料来源
• 1.5 河豚鱼
• 1.6 本课题研究的内容及意义
• 第二章 河豚鱼皮胶原蛋白肽的提取
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.1.1 原料
• 2.1.1.2 主要实验仪器
• 2.1.1.3 主要实验试剂
• 2.1.2 实验方法
• 2.1.2.1 河豚鱼皮胶原蛋白的提取
• 2.1.2.2 河豚鱼皮中总蛋白含量的测定
• 2.1.2.3 河豚鱼皮中胶原蛋白含量的测定
• 2.1.2.4 酶活力的测定
• 2.1.2.5 河豚鱼皮胶原蛋白水解液中肽得率的测定
• 2.1.2.6 河豚鱼皮胶原蛋白的酶解
• 2.1.2.7 河豚鱼皮胶原蛋白肽最佳提取条件的选择
• 2.1.2.8 酶解液对羟自由基（OH·）的清除作用
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 河豚鱼皮中总蛋白含量及胶原蛋白含量
• 2.2.2 最佳提取酶的选择
• 2.2.2.1 酶活力的测定
• 2.2.2.2 四种蛋白酶的酶解效果的比较
• 2.2.3 河豚鱼皮胶原蛋白肽最佳提取条件的单因素实验
• 2.2.3.1 酶加量对酶解反应的影响
• 2.2.3.2 温度对酶解反应的影响
• 2.2.3.3 底物浓度对酶解反应的影响
• 2.2.3.4 pH对酶解反应的影响
• 2.2.3.5 时间对酶解反应的影响
• 2.2.4 河豚鱼皮胶原蛋白肽最佳提取条件的正交实验结果
• 2.3 小结
• 第三章 河豚鱼皮胶原蛋白肽抗氧化性的研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.1.1 主要实验仪器
• 3.1.1.2 主要实验试剂
• 3.1.2 实验方法
• 3.1.2.1 河豚鱼皮胶原蛋白肽的超滤
• 3.1.2.2 对羟自由基（OH·）的清除作用
• 3.1.2.3 对二苯代苦味酰自由基（DPPH·）的清除作用
• 2^-·的清除作用'>3.1.2.4 对超氧阴离子自由基O₂^-·的清除作用
• 3.1.2.5 还原作用
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 河豚鱼皮胶原蛋白肽对OH·的清除作用
• 3.2.2 河豚鱼皮胶原蛋白肽对DPPH·的清除作用
• 2^-·的清除作用'>3.2.3 河豚鱼皮胶原蛋白肽对O₂^-·的清除作用
• 2^-·的清除作用'>3.2.3.1 不同分子量的河豚鱼皮胶原蛋白肽对O₂^-·的清除作用
• 2^-·清除作用'>3.2.3.2 分子量1kDa以下的河豚鱼皮胶原蛋白肽对O₂^-·清除作用
• 3.2.4 河豚鱼皮胶原蛋白肽的还原性
• 3.2.5 关于河豚鱼皮胶原蛋白肽的抗氧化活性
• 3.3 小结
• 第四章 河豚鱼皮抗氧化肽的分离纯化
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.1.1 主要实验仪器
• 4.1.1.2 主要实验试剂
• 4.1.2 实验方法
• 4.1.2.1 抗氧化活性的测定方法
• 4.1.2.2 超滤分离
• 4.1.2.3 DEAE Sepharose CL-6B离子交换柱层析
• 4.1.2.4 凝胶柱层析
• 4.1.2.5 脱盐
• 4.1.2.6 高效液相色谱
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 DEAE Sepharose CL-6B离子交换柱层析
• 4.2.2 Sephadex G-25凝胶柱层析
• 4.2.3 河豚鱼皮胶原蛋白肽纯化过程中抗氧化性的比较
• 4.2.4 高效液相色谱分离
• 4.2.4.1 河豚鱼皮胶原蛋白肽A-Ⅱ的HPLC谱图
• 4.2.4.2 河豚鱼皮胶原蛋白肽B-Ⅱ的HPLC谱图
• 4.3 小结
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录A Folin-酚溶液配制方法
• 附录B