论文题目: C/EBPβ在脂肪细胞分化过程中的调节
论文类型: 博士论文
论文专业: 生物化学与分子生物学
作者: 黄海艳
导师: 汤其群,宋后燕,马端,李希
关键词: 胎牛血清,小牛血清,前脂肪细胞,磷酸化,肥胖,顺序磷酸化,结合活性,脂肪细胞分化
文献来源: 复旦大学
发表年度: 2005
论文摘要: 肥胖症是指体内脂肪堆积过多和(或)分布不均匀，体重增加，是遗传因素和环境因素共同作用的结果。体重的增加，首先是脂肪细胞体积增大，然后脂肪细胞数目增多。脂肪细胞数量的增加是由于脂肪组织中存在的干细胞定向为前脂肪细胞，后者在一定因素的作用下，分化为脂肪细胞而形成的。因此研究脂肪细胞分化机制对肥胖的治疗具有重要意义。C／EBPβ在脂肪细胞分化程序中起重要作用。在脂肪细胞分化程序的早期C／EBPβ即有表达，C／EBPβ首先始动有丝分裂克隆扩增(mitotic clonalexpansion，MCE)，生长抑制的前脂肪细胞重新进入细胞周期，经历两轮左右的有丝分裂，然后退出细胞周期，进入细胞分化的终末阶段，随后C／EBPβ激活许多脂肪细胞表型基因(如，422／ap2；SCD1；Glut4；ob基因等)的共同转录激活因子C／EBPα和PPARγ基因的表达。C／EBPβ通过作用于C／EBPα和PPARγ启动子上的C／EBP调节元件发挥对C／EBPα和PPARγ基因的转录激活作用。有丝分裂克隆扩增和C／EBPα以及PPARγ的表达对于脂肪细胞分化均是必需的。因此C／EBPβ通过促进有丝分裂克隆扩增和激活C／EBPα以及PPARγ基因的转录，促进脂肪细胞的分化。在脂肪细胞分化的早期，诱导分化后2个小时内C／EBPβ虽有表达，但C／EBPβ获得DNA结合活性要经过很长一段时间的延迟。首先因为抑制因子CHOP-10与C／EBPβ相互作用，抑制C／EBPβ的DNA结合活性，其次处于低磷酸化状态的C／EBPβ具有很低的DNA结合活性。CHOP-10是C／EBP家族成员的转录抑制因子，与C／EBPβ形成异二聚体后，抑制C／EBPβ的DNA结合活性。在生长抑制的前脂肪细胞，CHOP-10表达很高，经诱导分化后，CHOP-10表达下调，释放与之形成二聚体的C／EBPβ，C／EBPβ可以进一步磷酸化，获得DNA结合活性并结合到着丝粒卫星DNA上，发挥转录激活作用。到目前为止，在脂肪细胞诱导分化早期，CHOP-10表达下调的原因和机制还不清楚，本文将对此做进一步的研究。C／EBPβThr188为MAPK磷酸化位点，对C／EBPβ的DNA结合活性是必需的，但并不足以激活靶基因。采用MS／MS，我们又鉴定了两个可能的GSK3β磷酸化位点：Ser184和Thr179。GSK3β磷酸化位点的特征：在其C末端4个氨基酸左右的氨基酸残基首先发生磷酸化后，GSK3β才能发挥作用。我们对C／EBPβSer184和Thr179位点的磷酸化特征及磷酸化后的C／EBPβ的DNA结合活性和转录激活功能进行了深入研究，以确定C／EBPβSer184和Thr179位点能否被GSK3β磷酸化；β磷酸化；C／EBPβSer184和Thr179位点的磷酸化是否依赖于MAPK对C／EBPβThr188的磷酸化；C／EBPβ的顺序磷酸化(首先MAPK磷酸化Thr188位点，然后GSK3β磷酸化Ser184或Thr179位点)或C／EBPβ的高磷酸化状态对C／EBPβ的DNA结合活性和转录激活功能的影响。一、CHOP-10在脂肪细胞分化过程中的表达调节在脂肪细胞分化的初期，CHOP-10表达下调对于C／EBPβ功能的发挥具有重要意义，因此我们对CHOP-10表达下降的原因进行了深入的研究。在3T3-L1前脂肪细胞诱导分化过程中，引入了不同的诱导剂(MDI)，包括0.5mM的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine，Mix)，1μM的地塞米松(Dexamethasone，Dex)，1μg／ml胰岛素(Insulin，I)，并将小牛血清换成了胎牛血清，这种改变可能是造成在脂肪细胞分化早期CHOP-10表达下调的原因。为此我们检测了不同诱导剂单独(M，D，I)及不同组合(MD，MI，ID，MDI)对CHOP-10表达的影响。结果表明，10％胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)本身就足以使CHOP-10表达下调。而作为对照的10％小牛血清(Calf serum，CS)使CHOP-10维持在很高水平。胎牛血清引起CHOP-10表达下调对于3T3-L1前脂肪细胞的分化起很重要的作用。因为用小牛血清替代胎牛血清诱导前脂肪细胞分化，使CHOP-10持续维持在很高的水平，脂肪细胞分化受到明显抑制，脂肪细胞特异性基因的表达起始明显延迟，表达的强度也明显减弱。在本试验中，我们也发现CHOP-10的表达与细胞生长周期的关系不是绝对的，因为在小牛血清的诱导分化方案中，即使细胞重新进入细胞周期(MCE)，细胞仍有很高水平CHOP-10的表达，而在胎牛血清中培养的前脂肪细胞，即使当细胞生长到接触抑制后，细胞内CHOP-10仍处于极低水平。以上结果提示，胎牛血清能下调生长抑制的前脂肪细胞CHOP-10的表达，而小牛血清能维持生长抑制的前脂肪细胞CHOP-10的表达。二、FBS引起CHOP-10表达下调的转录调控研究在脂肪细胞分化的初期，CHOP-10的表达下调发生在转录水平，因此我们检测了转录水平FBS对CHOP-10的调节。我们构建了CHOP-10全长启动子及5’系列缺失突变体的报告基因表达质粒，并分别转染用含10％小牛血清的培液及含10％胎牛血清的培液培养的约50％-60％的前脂肪细胞，当前脂肪细胞生长至接触抑制两天后，裂解细胞，检测报道基因活性，从而确定CHOP-10启动子上可能的胎牛血清反应元件的位置。CHOP-10启动子的5’系列缺失突变体报道基因活性分析表明在-578bp到-321bp区域存在可能的FBS反应元件，采用计算机分析软件分析此区域含有对血清刺激反应的转录因子SRF(Serum response factor)和YY1(Yin Yang 1)的结合位点。GMSA表明SRF不能结合到CHOP-10启动子SRE(Serum response element)位点上；YY1不仅能结合到此区域的YY1位点，也能结合到SRE位点，并且在胎牛血清培液培养的细胞与小牛血清培液培养的细胞中YY1结合到CHOP-10启动子上的能力存在差异。在胎牛血清培养的细胞中，有更多YY1结合到CHOP-10启动子上的YY1或SRE位点上。尽管YY1具有转录激活和转录抑制双重功能，但在CHOP-10启动子上结合的特点提示，YY1可能对CHOP-10启动子发挥转录抑制的功能。YY1在CHOP-10启动子上结合的差异可能是导致胎牛血清培液培养的细胞与小牛血清培液培养的细胞中CHOP-10表达差异的原因，也是脂肪细胞分化早期，FBS引起CHOP-10表达下调的原因。三、C／EBPβ的磷酸化调节我们深入研究了GSK3β对C／EBPβSerl84和Thrl79位点的磷酸化特征及与已知的C／EBPβThr188的MAPK磷酸化位点之间的关系和磷酸化后对C／EBPβ的DNA结合活性和转录激活功能的影响。体外磷酸化实验及功能研究表明单独的MAPK能使E．coli．中表达的野生型C／EBPβ蛋白质发生磷酸化，MS／MS结果表明磷酸化位点是C／EBPβThr188位的MAPK磷酸化位点，此时C／EBPβ的DNA结合活性仍很低。单独的GSK3β不能使C／EBPβ发生磷酸化。当MAPK与GSK3β共同作用时，C／EBPβ的磷酸化明显增强，MS／MS结果表明C／EBPβ磷酸化发生在Thr188位和Ser184位或Thr188位和Thr179位，为双磷酸化位点，此时C／EBPβ的DNA结合活性明显增强。说明6SK3β需要在MAPK对C／EBPβThr188位首先发生磷酸化后，才能使C／EBPβThr179和Ser184位点磷酸化。如果将Thr188，Thr179和Ser184位点均突变成丙氨酸，则MAPK和／或GSK3β均不能使突变的C／EBPβ蛋白质发生磷酸化，C／EBPβ也没有DNA结合活性，进一步说明C／EBPβ发生系列磷酸化对于C／EBPβDNA结合活性的重要性。我们针对以上3个位点构建了C／EBPβ的一系列突变体，以观察高磷酸化的C／EBPβ是否具有更好的转录激活功能。结果表明，随着C／EBPβ突变成谷氨酸位点的增多(类似体内磷酸化)，C／EBPβ对C／EBα启动子的转录激活功能增强，而随着C／EBPβ突变成丙氨酸位点的增多(类似体内去磷酸化)，C／EBPβ的转录激活功能降低。以上结果表明，C／EBPβThr179和Ser184位点是GSK3β磷酸化位点，GSK3β对C／EBPβThr179和Ser184位点磷酸化，依赖于MAPK对C／EBPβThr188的磷酸化；GSK3β对C／EBPβThr179和Ser184位点磷酸化后，C／EBPβDNA结合活性和转录激活功能明显增强。
论文目录:
中文摘要
英文摘要
引言
第一部分 CHOP-10在脂肪细胞分化过程中的表达调节
1. 材料和方法
2. 结果
3. 讨论
4. 小结
第二部分 FBS引起CHOP-10表达下调的转录调控研究
第一节 FBS引起CHOP-10表达下调的顺式作用元件区域研究
1. 材料和方法
2. 结果
第二节 FBS引起 CHOP-10启动子表达下调的反式作用因子的鉴定
1. 材料和方法
2. 结果
3. 讨论
4. 小结
第三部分 C/EBP β的磷酸化调节
1. 材料和方法
2. 结果
3. 讨论
4. 小结
全文总结与展望
全文参考文献
综述
参考文献
致谢
发布时间: 2007-06-28
参考文献
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