论文摘要
兰科（Orchidaceae）是有花植物中最大的一个科,具极高的观赏价值。石斛兰、文心兰是热带兰中的重要成员,主要分布于热带、亚热带。建兰花叶病毒（Cymbidium Mosaic Virus,CyMV）、齿兰环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus, ORSV）是危害兰花较为严重的病毒,这些病毒使得兰花的观赏价值受到影响。易普遍发生的兰花病毒CyMV和ORSV两种病毒严重影响和制约了海南石斛和文心兰的产量与品质,培育抗病毒的兰花新品种是兰花育种的一个重要研究方向。本研究以秋石斛的两个品种‘睡公主088’（Dendrobium ekapol’Sonia Earsakul 088’）,‘睡公主166’（Dendrobium ekapol’Sonia Earsakul 166’）及文心兰的一个品种黄金2号（Onicidium gold 2）为材料,应用农杆菌侵染和基因枪轰击两种转化方法进行了遗传转化,将分别携带CyMV和ORSV两种病毒外壳蛋白基因的表达载体pBI121转到以上几类兰花中,得到的试验结果如下：1.对3类兰花进行了卡那霉素敏感性试验：石斛兰两个品种类原球茎（PLBs）的卡那霉素最佳筛选浓度为150mg/L；文心兰黄金2号PLBs的卡那霉素最佳筛选浓度为100 mg/L。2.优化了农杆菌侵染转化法的条件：以继代培养2-3次的石斛兰类原球茎为转化受体材料,类原球茎经农杆菌菌液（OD600值为1.0）侵染30 mmin后24℃共培养4 d,用头孢霉素（500 mg/L）脱菌后转接到卡那霉筛选培养基进行筛选培养。3.优化了基因枪转化法条件：采用直径1.0μm钨粉微粒载体,在1100 psi轰击压力下,9 cm轰击距离、25 mgHg真空度,每皿轰击一枪,轰击后,经过20 d过渡培养后,转入含有卡那霉素的抗性筛选培养基中筛选。4.抗性植株的PCR检测：对转化后且移栽到温室中成活的再生植株进行CyMV-CP和ORSV-CP基因的PCR检测,共检测189株抗性苗,其中51株PCR结果为阳性,阳性率为27.0%,石斛兰‘睡公主166’（Dendrobium ekapol’Sonia Earsakul 166’）的阳性率为28.0%,石斛兰‘睡公主088’（Dendrobium ekapol’Sonia Earsakul 088’）的阳性率为26.4%,文心兰黄金2号阳性率为27.6%,农杆菌转化法的阳性率为33.3%,基因枪轰击转化法的阳性率为20.8%,转CyMV-CP基因的阳性率为27.5%,转ORSV-CP基因的阳性率为27.7%。初步证明外源基因已经整合到兰花的基因组中。5.利用实时荧光定量RT-PCR方法,以石斛转CyMV-CP基因PCR检测阳性植株为实验材材料,对CyMV-CP基因在转基因石斛内表达量进行分析：CvMV-CP基因在转基因石斛兰体内得到较高水平的表达,相对表达量分别是对照植株的0.83倍、1-39倍。