Ochrobactrum L-3的L-肉碱脱氢酶研究

论文摘要

L-肉毒碱（L-Camitine,CN）又叫L-肉碱、维生素BT、左卡尼汀,化学名称为L-β-羟基-γ-三甲胺丁酸。L-肉碱是一种基本的细胞成分.主要位于线粒体内膜上,是长链脂肪酸进入线粒体的运输载体。自从1973年Engel报告第一例人类CN缺乏症（CD）以来,有关L-肉碱的生理生化,CD的病理和临床报告日渐增多,成为临床医学和营养学的一个重要课题。L-肉碱作为药物治疗由CD引起的各种疾病取得了很好的效果,其生产方法的改进和创新对于L-肉碱的大规模生产具有重要意义。目前生产L-肉碱的方法中,酶转化法具有环境友好、成本低、产品安全性高等特点,是较有吸引力的方法。在酶转化法中,L-肉碱脱氢酶（EC 1.1.1.108）是所需要的一个重要的酶,因此它的性质对该方法的使用和推广非常重要。虽然已有少量文献对此类酶进行了报道,但在这些已报道的酶中,大多数都存在着酶活和专一性不高的问题。本研究从土壤中分离筛选到一株产L-肉碱脱氢酶菌株L-3,对其进行了系统地分类学鉴定,并研究了该菌株产L-肉碱脱氢酶的发酵条件,进行了该酶的纯化和对酶性质研究。主要实验结果如下:1.菌株的筛选分离及鉴定经过富集培养划线分离纯化后,得到了一株能够生产L-肉碱脱氢酶的菌株,通过对该菌株的形态学研究,生理生化测定,16SrDNA测序和系统发育分析,确定菌株L-3属于苍白杆菌属（Ochrobactrum sp）。2、菌株产酶发酵研究对菌株L-3产酶发酵的条件进行了研究。研究采用摇瓶培养试验,以测定菌体生长量、酶活性为指标,确定了该菌株产酶发酵的最佳条件为,培养基组成:0.5%L-肉碱,0.2%葡萄糖,0.2%K2HPO4·3H2O,0.05%KH2PO4,0.05%MgSO4·7H2O,1.0%（v/v）微量元素（包括5.2%ZnSO4,5.0%FeSO4·7H2O,5.0%CuSO4·7H2O和0.05%MnSO4·H2O）,pH 6.5。培养温度30℃,装液量为100 mL三角瓶装20 mL培养基,于120 rpm转速下培养24 h。在上述培养条件下发酵,发酵液的酶活可达1.46U/ml。3.酶的纯化和性质研究在发酵罐中培养10L菌液,离心收集,沉淀经超声波破壁后得到粗酶液。粗酶液经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Cellulose离子交换层析、Toyopearl Hw一65C疏水层析、Sephadex G一75分子筛层析后,纯度提高约51倍,比活达到2.55U/mg。聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）显示为单一条带,分子量约为57kD。研究L一肉碱脱氢酶的特性得知:该酶反应的最适pH为9.5;最适作用温度为50C:在pH6.011.0、55℃以下稳定;对L-肉碱的Km值为5.9mmol/L,转化系数Kcat为3.4/s:Hg2’,pb2+等几乎使该酶完全失活。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 前言
• 1.1 L-肉碱的结构与功能
• 1.2 L-肉碱的体内合成
• 1.3 L-肉碱在体内的分布与代谢
• 1.3.1 L-肉碱在人体内的分布
• 1.3.2 L-肉碱在人体内的代谢
• 1.4 L-肉碱与相关疾病的关系
• 1.4.1 遗传性 L-肉碱代谢缺陷
• 1.4.2 继发性 L-肉碱缺乏症
• 1.4.3 L-肉碱与缺血性心脏病
• 1.4.4 L-肉碱与慢性肝脏疾病
• 1.4.5 L-肉碱与肾功能不全及血液透析
• 1.4.6 L-肉碱与神经系统疾病
• 1.5 L-肉碱的生产方法
• 1.5.1 提取法
• 1.5.2 化学合成法
• 1.5.3 不对称合成法
• 1.5.4 微生物发酵法
• 1.5.5 微生物酶转化法
• 1.6 L-肉碱脱氢酶的研究概况
• 1.7 本研究的目的及内容
• 第二章 产 L-肉碱脱氢酶菌株的分离及鉴定
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株的分离源
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 培养基
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 富集
• 2.2.2 菌株的分离纯化
• 2.2.3 酶活的测定方法
• 2.2.4 菌株 L-3的鉴定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 产 L-肉碱脱氢酶菌株的筛选
• 2.3.2 产酶菌株 L-3的鉴定
• 第三章 菌株 L-3产酶的发酵条件研究
• 3.1 试验方法
• 3.1.1 基础培养基
• 3.1.2 培养条件
• 3.1.3 生长量的测定
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 培养时间对 L-3菌株产酶的影响
• 3.2.2 氮源对菌株 L-3产 L-肉碱脱氢酶的影响
• 3.2.3 碳源对菌株 L-3产 L-肉碱脱氢酶的影响
• 3.2.4 葡萄糖浓度对菌株 L-3产 L-肉碱脱氢酶的影响
• 3.2.5 起始pH对菌株产酶的影响
• 3.2.6 通气量对菌株产酶的影响
• 3.2.7 诱导物对菌株 L-3产 L-肉碱脱氢酶的影响
• 3.2.8 L-肉碱浓度对菌株 L-3产 L-肉碱脱氢酶的影响
• 3.3 结论
• 第四章 酶的纯化及其性质研究
• 4.1 材料
• 4.1.1 材料及试剂
• 4.1.2 主要仪器
• 4.2 方法
• 4.2.1 主要方法
• 4.2.2 纯化步骤
• 4.2.3 酶性质的研究
• 4.3 结果及分析
• 4.3.1 L-肉碱脱氢酶的纯化结果
• 4.3.2 L-肉碱脱氢酶的理化性质
• 第五章 结论与展望
• 5.1 研究结论
• 5.1.1 产 L-肉碱脱氢酶菌株的分离及鉴定
• 5.1.2 菌株 L-3的产酶发酵条件
• 5.1.3 酶的纯化和性质研究
• 5.1.4 讨论
• 5.2 展望
• 参考文献