牛的成熟配子，体外受精胚以及克隆胚中多能性相关基因5’端区域的甲基化模式

论文摘要

牛的体外受精与体细胞核移植一直是国内外研究的热点,其效率在很大程度上受配子的体外成熟和胚胎体外培养的影响,尤其是8-细胞到桑椹胚阶段极为关键,所对应的时期是所谓的“母型-合子型过渡期”。在分子水平上,体外环境的影响表现为表观遗传的修饰,其中DNA甲基化是一种重要的修饰手段,而且是基因表达调控的一种方式。由于胚胎发生过程受到复杂精细的基因表达调控网络的调节,且多能性相关基因在早期的胚胎发育中扮演了重要的角色。对于启动子区拥有CpG岛的多能性相关基因,甲基化调控方式占据了主导地位。因此,多能性相关基因的甲基化模式与胚胎的发育潜能有很大的相关性。它们的异常甲基化水平常常会引起胚胎发育阻滞和畸形。基于此,本研究通过在成熟配子,体外受精胚和克隆胚的8-细胞和桑椹胚以及供体细胞中,以5个具有代表性的多能性相关基因（Oct4、Sox2、Nanog、Rex1和Fgf4）为标志,对其甲基化水平及变化趋势进行了检测,并对胚胎的发育率进行了统计学分析,为今后深入研究多能性相关基因在配子成熟期以及胚胎早期的母型-合子型过渡期的表观重编程提供了依据,同时为解释克隆胚胎发育率低下的原因提供了新的证据,也为以多能性基因的甲基化模式为参照来评估胚胎的发育潜能提供了一个可能的标准。1.检测了5个多能性相关基因（Oct4、Sox2、Nanog、Rex1和Fgf4）在牛的获能精子和成熟卵母细胞中的甲基化模式。结果表明,Sox2和Nanog在卵母细胞中的甲基化水平分别为1.7%和24.6%,在精子中的甲基化水平分别为0%和22.3%。两个基因在配子中均为低甲基化状态,未呈现配子特异性甲基化模式。相反,Oct4、Rex1和Fgf4在卵母细胞中的甲基化水平分别为49.6%、75%和13.6%,在精子中的甲基化水平分别为79.1%、98.6%和99.1%。相对而言,三个基因在卵母细胞中呈现低甲基化状态,而在精子中呈现高甲基化状态,表现出了配子特异性的甲基化模式。2.检测了5个多能性相关基因（Oct4、Sox2、Nanog、Rex1和Fgf4）在牛的体外受精胚胎的8-细胞和桑椹胚阶段（母型-合子型过渡期）的甲基化模式。结果表明,Oct4、Sox2、Nanog、Rex1和Fgf4这五个基因的甲基化状态在体外受精8细胞胚胎中分别为56.52% （130/230）、0.83% （2/240）、31.54% （41/130）、91.36% （201/220）和50.91% （56/110）,在体外受精桑椹胚中分别为31.3% （72/230）、2.08% （5/240）、27.70% （36/130）、59.54% （131/220）和40.91% （45/110）。从以上结果得出,在牛的体外受精胚的母型-合子型过渡期Oct4、Nanog、Rex1和Fgf4分别发生了不同程度的去甲基化,其中Sox2没有变化,始终保持非甲基化状态,与整体甲基化水平变化趋势相反。3.检测了5个多能性相关基因（Oct4、Sox2、Nanog、Rex1和Fgf4）在核移植胚胎的8-细胞和桑椹胚阶段（母型-合子型过渡期）以及供体细胞中的甲基化模式。结果表明,Oct4、Sox2、Nanog、Rex1和Fgf4这五个基因的甲基化状态在8细胞核移植胚中分别为61.74% （142/230）、4.16% （10/240）、3.84% （5/130）、91.82% （202/220）和7.27% （8/110）,在核移植桑椹胚中分别为38.70%（89/230）、5.0% （12/240）、9.23% （12/130）、85.50% （188/220）和12.73% （14/110）,在供体细胞中分别为94.78%、0.83%、48.46%、90%和6.36%。从以上结果得出,在母型-合子型过渡期,Oct4和Rex1分别发生了23.04% （P<0.01）和6.02% （P>0.05）的去甲基化,而Sox2、Nanog和Fgf4分别经历了0.84% （P>0.05）,5.39% （P>0.05）和5.46% （P>0.05）的重新甲基化。值得注意的是,Sox2在第十四个甲基化位点在母型-合子型过渡期始终保持高甲基化,其它位点正常。通过与体外受精胚相比,在核移植胚中只有Oct4和Sox2在整体上经历了正确的甲基化重编程。由此得出,在核移植胚中这五个多能性基因在母型-合子型过渡期遭受了不完全的DNA甲基化重编程。4.体外受精胚胎和核移植胚胎各个阶段发育率的统计结果表明,体外受精胚胎在2-细胞、8-细胞、桑椹胚和囊胚的发育率分别为81.44% （215/264）、56.44% （149/264）、42.80% （113/264）和29.55% （78/264）;核移植胚胎在2-细胞、8-细胞、桑椹胚和囊胚的发育率分别为77.02% （191/248）、51.61% （128/248）、38.71% （96/248）和24.60% （61/248）。统计分析,核移植胚胎与体外受精胚胎相比,发育率无显著差异。这可能是因为Oct4和Sox2在核移植胚中整体上经历了正确的甲基化重编程的缘故。考虑到这两个基因在8-细胞、桑椹胚和囊胚阶段起着至关重要的作用,所以发育率在囊胚之前未出现显著性差异。然而,克隆胚胎的低附植率,高流产率,高出生后畸形率,这可能在一定程度上与Nanog、Rex1和Fgf4的异常甲基化重编程有关。因为这些基因在胚胎的晚期发育中发挥着关键作用。由此得出,Oct4、Sox2、Nanog、Rex1和Fgf4的甲基化模式可以作为评价克隆胚胎发育潜能的标准。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 哺乳动物DNA 甲基化研究进展
• 1.1 DNA 甲基化概述
• 1.1.1 DNA 甲基化酶
• 1.1.2 DNA 甲基化结合蛋白
• 1.2 配子发生与DNA 甲基化
• 1.2.1 雄性配子与DNA 甲基化
• 1.2.2 雌性配子与DNA 甲基化
• 1.3 胚胎发生与DNA 甲基化
• 1.4 基因表达与DNA 甲基化
• 1.5 结语与展望
• 第二章 牛的成熟配子中多能性相关基因5’端区域的甲基化模式
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 精子DNA 的提取结果
• 2.2.2 甲基化片段PCR 扩增结果
• 2.2.3 扩增的CpG 岛的甲基化状态
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 第三章 牛体外受精胚胎母型-合子型过渡期多能性相关基因5’端区域的甲基化模式..
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 甲基化片段PCR 扩增结果
• 3.2.2 扩增的CpG 岛的甲基化状态
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 第四章 牛核移植胚胎母型-合子型过渡期多能性相关基因5’端区域的甲基化模式
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 供体细胞原代培养
• 4.2.2 供体细胞的纯化
• 4.2.3 体外受精胚胎和体细胞核移植胚胎各阶段的发育率
• 4.2.4 供体细胞DNA 的提取结果
• 4.2.5 甲基化片段PCR 扩增结果
• 4.2.6 扩增的CpG 岛的甲基化状态
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介