胸膜肺炎放线杆菌PCR定向突变系统的初步建立及胸膜肺炎放线杆菌OmlA-ELISA检测方法的建立

论文题目: 胸膜肺炎放线杆菌PCR定向突变系统的初步建立及胸膜肺炎放线杆菌OmlA-ELISA检测方法的建立

论文类型: 博士论文

论文专业: 动物遗传育种与繁殖

作者: 刘军发

导师: 陈焕春,熊远著

关键词: 胸膜肺炎放线杆菌,动物回归试验,血清学检测,酶标记免疫附测定法,定向突变系统,毒素

文献来源: 华中农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 猪传染性胸膜肺炎(Porcine Contagious Pleuropneumonia，PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的猪的一种高度接触传染性呼吸道疾病，给世界各地的养猪业造成了巨大的经济损失。 该病由Pattison等于1957年首次报道，目前流行于世界各地。胸膜肺炎放线杆菌目前已经划分了15个血清型，利用本地主要流行的血清型免疫接种是预防和控制该病的主要措施，目前我国用于预防猪传染性胸膜肺炎的主要疫苗是灭活疫苗，对全国各地的流行情况进行调查，分离各地优势流行胸膜肺炎放线杆菌血清型，有助于有效的控制该病在我国的流行和爆发；但这种由优势血清型制备的灭活疫苗对于同种血清型的感染可降低死亡率，但不能降低发病率，不能阻止肺部病变和慢性感染，更不能对异型菌的感染提供有效的交叉保护，这就迫切需要更加安全、有效的疫苗来预防和控制该病的发生与流行。 要研制有效的新型疫苗，就必须对该菌的致病机理进行研究，着就需要有效的研究工具，能够高效精确的对胸膜肺炎放线杆菌的致病机理进行研究，能够成功的克服胸膜肺炎放线杆菌比较强的修饰限制系统，从而为弱毒菌及其它新型疫苗的的研制打下坚实的基础。 胸膜肺炎放线杆菌目前发现的毒素共有四种，分别是毒素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和毒素Ⅳ，毒素毒素Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的结构及功能已经基本上研究的比较清晰，但毒素Ⅳ的功能还没有完全研究清楚，特别是毒素Ⅳ的激活基因、作用方式、结构组成都还不是非常清晰。所以非常有必要对其功能进行更为彻底的研究。 鉴于上述背景，本研究从临床上分离了胸膜肺炎放线杆菌XT0404株，通过动物回归试验复制了猪的传染性胸膜肺炎；由于临床了检测的阳性率很高而细菌的分离率却很低，为了研究其原因，研究了链球菌、副猪嗜血杆菌、支气管败血波氏杆菌、变形杆菌和大肠杆菌对胸膜肺炎放线杆菌血清学检测的干扰；为提高检测的准确度，建立了基于融合表达的外膜脂蛋白上的ELISA检测方法；同时改进了链霉菌中的PCR定向突变系统，并将改进后的PCR定向突变系统应用的到胸膜肺炎放线杆菌中来失活毒素Ⅳ的ORF1，主要研究内容包括： 1．XT0404株的分离鉴定及动物回归试验 利用TSA培养基，从湖南湘潭一猪场的病料上分离出了胸膜肺炎放线杆菌，经鉴定为血清型2，命名为XT0404，研究了该菌的药物敏感性及小白鼠的半数致死量；还利用该菌人工感染胸膜肺炎放线杆菌抗体阴性的猪，复制出了典型的传染性胸膜肺炎，观测了发病猪的临床症状，制备了病理切片及电镜切片来观测其病理变化；对耐过胸膜肺炎放线杆菌XT0404株感染的猪又进行了其它血清型的人工感染试验。 2．PCR定向突变系统在胸膜肺炎放线杆菌中的建立 PCR定向突变系统是一个比较新的突变系统，主要是利用了PCR引物两端的缺

论文目录:

摘要

Abstract

缩略词(Abbreviation)

第1章 文献综述

1.1 胸膜肺炎放线杆菌发现历史

1.2 猪传染性胸膜肺炎的流行现状及其危害

1.2.1 猪传染性胸膜肺炎的流行现状

1.2.2 猪传染性胸膜肺炎的危害

1.3 胸膜肺炎放线杆菌的检测和防制

1.3.1 胸膜肺炎放线杆菌的检测方法的研究进展

1.3.2 猪传染性胸膜肺炎的防制

1.4 胸膜肺炎放线杆菌毒力因子研究进展

1.4.1 荚膜(capsule,CP)

1.4.2 脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)

1.4.3 外膜蛋白(outer membrane proteins,OMP)

1.4.4 转铁结合蛋白(transferrin binding proteins,Tbp)

1.4.5 酶类(Enzymes)

1.4.6 粘附因子(adherence factor)

1.4.7 外毒素(RTX-toxins,Apx)

1.5 胸膜肺炎放线杆菌突变株构建方法的研究进展

1.5.1 自然突变

1.5.2 人工常规诱变

1.5.3 分子生物学方法

1.6 PCR定向突变系统的研究进展

1.6.1 PCR定向突变系统在酿酒酵母中的首次建立

1.6.2 PCR定向突变系统在假丝酵母中的改进

1.6.3 λ噬菌体Red重组酶在PCR定向突变系统中的应用

1.6.4 FLP重组酶在PCR定向突变系统中的应用

1.6.5 结合转移起始位点oriTRK2在PCR定向突变系统中的应用

1.6.6 PCR定向突变系统的优点

1.6.7 PCR定向突变系统的缺点及发展趋势

第2章 胸膜肺炎放线杆菌XT0404株的分离鉴定及耐药性研究

2.1 研究目的

2.2 材料和方法

2.2.1 试验动物及病料

2.2.2 主要药品及试剂配制

2.2.3 细菌的分离和鉴定

2.2.4 分离株与血清型2参考菌株S1536的对比

2.2.5 药敏试验

2.2.6 动物回归试验

2.2.7 对耐过动物的人工感染试验

2.2.8 小鼠半数致死量(LD_(50))的确定(寇氏(Korbor)法)

2.3 结果与分析

2.3.1 细菌的分离与鉴定

2.3.2 分离株XT0404与参考菌株S1536的对比

2.3.3 分离株XT0404的药敏试验

2.3.4 动物回归试验

2.3.5 对耐过动物的人工感染试验

2.3.6 小鼠半数致死量(LD_(50))的测定

2.4 讨论

第3章 胸膜肺炎放线杆菌PCR定向突变系统建立及应用该系统失活apx ⅣA的ORF1基因

3.1 研究目的和意义

3.2 材料与方法

3.2.1 质粒和菌株

3.2.2 主要药品及试剂配制

3.2.3 PCR定向突变系统在胸膜肺炎放线杆菌中的建立

3.2.4 用PCR定向突变系统失活胸膜肺炎放线杆菌apxⅣ的ORF1基因

3.3 结果

3.3.1 中断盒的改进

3.3.2 apxⅣ基因的ORF1大片段的克隆

3.3.3 在大肠杆菌中用中断盒置换ORF1

3.3.4 FLP重组酶介导的中断盒的敲除

3.3.5 质粒pT-ORF1genoW△ORF1：：FRT：：cassette的构建

3.3.6 有选择性标记的胸膜肺炎放线杆菌突变体的产生

3.4 讨论

3.4.1 PCR定向突变系统的选择

3.4.2 中断盒的改进

3.4.3 同源重组方式的改进

3.4.4 供体菌的更换

3.4.5 胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅳ的OFR1的失活

3.4.6 改进后的PCR定向突变系统在胸膜肺炎放线杆菌突变株构建中的优势

3.4.7 在胸膜肺炎放线杆菌建立的PCR定向突变系统的不足之处

第4章 胸膜肺炎放线杆菌外膜脂蛋白(OmlA)ELISA检测方法的建立

4.1 研究目的和意义

4.2.材料和方法

4.2.1 菌株、质粒和试验动物

4.2.2 培养基及试剂

4.2.3 血清

4.2.4 检测抗原的制备

4.2.5 抗血清的制备

4.2.6 制备的抗血清与胸膜肺炎放线杆菌标准抗原交叉反应的测定

4.2.7 融合表达质粒的构建

4.2.8 融合蛋白的表达、纯化和鉴定

4.2.9 OmlA-ELISA方法的建立

4.3 结果

4.3.1 制备的抗血清的效价检测

4.3.2 抗血清与14种血清型胸膜肺炎放线杆菌标准抗原的凝集反应

4.3.3 omlA基因的克隆与表达

4.3.4 OmlA-ELISA方法的建立

4.4 讨论

第5章 结论

参考文献

附录

致谢

发布时间: 2006-12-12

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