线粒体活性氧与糖尿病视网膜病变关系及机制的研究

论文摘要

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是发达国家最常见的致盲原因之一。对于其发病的分子机制，目前有四种假说：多元醇途径（polyol pathway）的增加；糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）的形成增加；蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）的激活；己糖胺途径（hexosamine pathway）的增加。虽然每种假说都有相应的实验依据，但是四种假说都只能解释糖尿病性视网膜病变的部分病理过程。目前，一种新的假说被提出：线粒体活性氧（mitochondrialsuperoxide）产生增多，并认为这是其他几条途径的启动因素。我们知道线粒体是细胞内产生活性氧的关键部位，高血糖通过某些途径诱导线粒体活性氧产生增多，然后启动了上述四种病理生理过程。因此，有效阻断此途径有望防止糖尿病性视网膜病变的发生。那么，高血糖时线粒体活性氧是如何增加的?高血糖时线粒体活性氧产生增加，是否与线粒体抗氧化防御机制减弱有关?作为最主要的线粒体抗氧化酶—线粒体超氧化物岐化酶（manganese superoxide dismutase，MnSOD），在高血糖条件下，其表达或活性是否受到了抑制从而导致了活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生的增加?解藕联蛋白（uncoupling proteins，UCPs）是一类与线粒体活性氧产生关系密切的线粒体膜蛋白。它可以通过催化质子通过线粒体内膜渗漏来调节线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，△ψ），继而调节线粒体活性氧的产生。不同的组织表达不同的解藕联蛋白UCP1-UCP5异构体，作为糖尿病高血糖损害的主要靶位，视网膜血管内皮细胞及周细胞中分布的是哪种UCPs的异构体?糖尿病高血糖时其表达有何变化?本研究从分子水平入手，采用共聚焦显微镜、流式细胞仪、免疫组化及RT-PCR等方法研究这些尚未明确的问题，揭示糖尿病视网膜病变的分子机制，从而探讨有效的预防措施，为糖尿病早期甚至在亚疾病阶段的预防性治疗提供理论依据。第一部分高糖对牛视网膜微血管内皮细胞和周细胞线粒体活性氧的影响目的观察高糖条件下培养的牛视网膜微血管内皮细胞、周细胞线粒体活性氧产生量的变化，研究导致此种变化的原因及所致影响，探讨糖尿病视网膜病变的发生机制。方法①采用选择性培养方法培养牛视网膜微血管内皮细胞、周细胞，通过共聚焦显微镜检测不同葡萄糖浓度下内皮细胞、周细胞线粒体活性氧产生量的变化。②采用流式细胞仪检测不同葡萄糖浓度下线粒体膜电位、细胞死亡率的变化。③免疫细胞化学及免疫荧光方法检测内皮细胞、周细胞表达UCP1-5中何种异构体。RT-PCR检测培养细胞MnSOD、解藕联蛋白UCP1-3表达情况以及不同葡萄糖浓度下的变化。结果①随着培养基中葡萄糖浓度的增加，内皮细胞、周细胞线粒体活性氧的产生呈增多趋势。②随着培养基中葡萄糖浓度的增加，内皮细胞线粒体膜电位逐渐升高，细胞死亡率逐渐增多，而周细胞则无此变化趋势。③经免疫细胞化学及免疫荧光方法检测，牛视网膜微血管内皮细胞、周细胞中UCP1及UCP2两种异构体表达呈阳性，而UCP3、UCP4及UCP5均呈阴性。通过RT-PCR检测到UCP1、UCP2 mRNA，不表达UCP3。UCP1、2、MnSOD表达量随培养基中葡萄糖浓度的变化而变化。结论高糖可以诱导培养的视网膜微血管内皮细胞、周细胞线粒体活性氧产生增多；内皮细胞活性氧产生的增多与线粒体膜电位增高之间存在反馈调节；牛视网膜微血管内皮细胞、周细胞表达UCP1及UCP2两种异构体；高糖条件下UCP1、2、MnSOD表达量代偿性增多调节活性氧的产生，但是当葡萄糖浓度升高到一定程度时，代偿机制消失；内皮细胞、周细胞在高糖条件下表现出的不同特征，说明其在糖尿病性视网膜病变的发生中起着不同的作用。第二部分STZ诱导的糖尿病大鼠视网膜中UCPs及MnSOD表达的变化目的①观察STZ诱导糖尿病大鼠眼部病变特点，糖尿病性白内障、糖尿病性视网膜病变发生情况。②探讨一种视网膜血管的三维检查方法。③检测正常大鼠视网膜中UCPs的表达类型，以及UCPs、MnSOD mRNA表达随糖尿病病程的变化，探讨糖尿病性视网膜病变发病的分子机制。方法①选取Sprague-Dawley（SD）大鼠，以STZ尾静脉注射诱导建立糖尿病模型，利用现代的检测手段如光学相干断层扫描、眼底荧光血管造影，详细观察STZ诱导糖尿病大鼠眼部特点。②将大鼠深度麻醉后，行全身循环灌注，至眼球变苍白，再灌注4％多聚甲醛作血管内固定。取双眼以4％多聚甲醛固定24h后，取出视网膜，改良视网膜血管消化铺片方法，采用胶原酶消化制备视网膜血管铺片，经免疫荧光染色后采用激光扫描共聚焦显微镜观察。③通过免疫荧光方法检测正常SD大鼠视网膜血管网中UCPs异构体的表达；收集正常SD大鼠的神经视网膜组织，RT-PCR方法检测其UCP1-5五种异构体及MnSOD的表达，同时取大脑皮质、骨骼肌、晶状体做为阳性对照，评价其正常情况下的表达量；在STZ诱导糖尿病大鼠模型建立后2周、4周、6周、8周及12周分别收集大鼠的视网膜组织，通过RT-PCR方法检测UCPs及MnSOD的mRNA表达量的变化。结果①糖尿病模型建立12周时有10／19（52.6％）只大鼠发生糖尿病性白内障，16周时有9／13（69.2％）只大鼠发生糖尿病性白内障。至16周时，通过眼底检查、OCT、FFA等检查，未发现视网膜病变的发生。②胶原酶消化处理后可获得完整、理想的视网膜血管铺片，通过免疫荧光染色、激光扫描共聚焦显微镜扫描，可以观察到视网膜血管三维特征。③免疫荧光检测发现正常大鼠视网膜血管网UCP1及UCP2表达阳性；RT-PCR检测发现，正常大鼠神经视网膜组织中表达UCPs异构体种类与脑皮质中相同，即表达UCP2、UCP4、UCP5、MnSOD，与β-actin表达量比值分别为0.56±0.09、0.58±0.11、0.96±0.06、0.63±0.05，均低于脑皮质中表达量；在不同糖尿病病程时，UCPs及MnSOD表达量有所变化，一般表现为随病程先升高，然后降低的变化趋势。结论①在16周时，STZ诱导的糖尿病大鼠视网膜病变仍处于背景期，适用于糖尿病视网膜病变早期病理机制的研究。STZ诱导的糖尿病模型，白内障发病率较高，适用于糖尿病性白内障发病机制及治疗方法的研究。②改良的视网膜血管消化铺片联合共聚焦显微镜观察是一种有效的视网膜血管三维检查方法。③正常大鼠视网膜血管网表达UCP1及UCP2；而整个神经视网膜中表达UCPs异构体种类与脑皮质中相同，即表达UCP2、UCP4、UCP5，其中UCP4及UCP5可能特异性地表达于视网膜的神经组织；UCP2、UCP4、UCP5、MnSOD的mRNA表达量随糖尿病病程的变化，与糖尿病性视网膜病变的发生有关，推测可能与线粒体活性氧产生增多有关。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 高糖对牛视网膜微血管内皮细胞和周细胞线粒体活性氧的影响
• 第一节 高糖对牛视网膜微血管内皮细胞和周细胞的影响
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二节 高糖条件下细胞线粒体活性氧、线粒体膜电位及细胞死亡率的变化
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第三节 高糖条件下牛视网膜微血管细胞UCPs、MnSOD表达的变化
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第一部分小结
• 第二部分 STZ诱导的糖尿病大鼠视网膜中UCPs及MnSOD表达的变化
• 第一节STZ诱导的糖尿病大鼠模型的建立及观察
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二节 大鼠视网膜血管消化铺片的制备及UCPs、MnSOD的表达
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第三节 不同病程糖尿病大鼠视网膜UCPs、MnSODmRNA的表达变化
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分小结
• 总结与展望
• 参考文献
• 综述一
• 综述二
• 在校期间发表论文
• 在校所获奖项和获得资助的课题
• 致谢