论文摘要
节杆菌是土壤中最常分离到的土著性需氧微生物。节杆菌属的成员不仅可以降解各种环境污染物,而且有能力抵御各种环境压力,例如低温、干燥、饥饿、电离辐射、高渗透压等。有报道指出,节杆菌的抗逆性可能与其体内存在多种海藻糖合成的基因有关。在大多数生物体内,海藻糖主要生物合成途径包含6-磷酸海藻糖合成酶（TPS）和6-磷酸海藻糖酯酶（TPP）。由于TPP丰富的生物学功能及其在抗逆境胁迫中可能发挥的重要作用引起了人们极大的兴趣。然而目前有关TPP的研究主要集中在高温和中温微生物中,在低温微生物中还未见报道；而且对这些基因进行克隆、过表达、敲除以及合成途径的研究离不开高效的转化系统。因此,本研究采用节杆菌典型的组成型表达载体pART2对一株耐冷菌Arthrobacter sp. A3进行电转化条件的优化研究,并进一步对TPP的功能进行了深入研究。获得的主要研究结果如下：（1）通过对整个电转化过程中所涉及的因素进行系统分析,首次建立了一种简单、快速、转化水平最高的适用于节杆菌属的高效电转化方法。在所测定的因素中,在细胞对数生长初期加入青霉素处理,以及电击与复苏基质中0.5 M山梨醇的存在,可以导致转化效率增加幅度最大并使结果具有一致性；在最优化的电击条件下,Arthrobacter sp. A3的转化效率可达到6.8×107个转化子/μgpART2;可以保证一个转化实验在10分钟内完成；成功将该方法应用于节杆菌的其他5种典型物种,都得到了较高的转化效率。这一方法是节杆菌基因操作的有效工具,有助于推动这一具有重要经济意义的生物群体的研究。（2）克隆得到Arthrobacter sp. A3 6-磷酸海藻糖酯酶基因。通过热不对称交错RCR （TAIL-PCR）,从Arthrobacter sp. A3中得到编码6-磷酸海藻糖酯酶的基因tpp,该基因含有801bp的开放阅读框,编码266个氨基酸；通过生物信息学分析其氨基酸序列,发现不具有信号肽序列和跨膜区,表明TPP为胞内酶；BLASTP结果显示TPP属于HAD超家族。（3）实现Arthrobacter sp. A3 tpp基因在大肠杆菌中的异源表达,并完成了重组TPP的纯化。重组酶在表观上与预测的分子量27.9 kDa一致。（4）阐明了来源于Arthrobacter sp. A3的重组TPP可能是一种新的适冷酶。研究发现该酶表现出对Mg2+或Co2+的绝对需求; Arthrobacter sp. A3 TPP最适pH值范围较宽（5.0～7.5）,而其他验证功能的6-磷酸海藻糖酯酶却无此特征；TPP最适反应温度约为30℃,也是重组TPP酶达到最高Kcat/Km（催化效率）时的温度；TPP在4℃可以保持最大活性的75%,表明该酶在低温下稳定；在50℃热激处理6分钟就会失去70%的活性,说明该酶通常不耐热；重组TPP Kcat/Km最大值为37.5mM-1·s-1,远远高于已报道的来源于中温菌大肠杆菌的TPP。在20℃时,重组TPP Km值达到最小,但是,即使在4℃,相比于其他已经报道的微生物的TPP,该酶仍具有最低的Km值。所有这些特性都与适冷酶的特征相吻合。（5）揭示了tpp在Arthrobacter sp. A3抵御低温胁迫中具有重要作用。实现Arthrobacter sp. A3 tpp基因的同源表达；我们发现在Arthrobacter sp. A3体内过表达tpp,可以使该菌0℃时的生存率略有提高。tpp过表达菌株在0℃生存率的提高,以及TPP较低的最适温度水平和低温下保持高催化效率的特征,表明tpp与Arthrobacter sp. A3在低温下生存具有一定相关性。综上所述,本研究对来源于耐冷节杆菌属TPP进行了首次报道。不仅为节杆菌tpp功能研究提供了科学依据,而且为研究低温菌蛋白以及节杆菌适应低温环境的作用机制奠定了理论基础。