安徽部分地区鸭疫里氏杆菌的分离鉴定及其生物学特性研究

论文摘要

鸭疫里氏杆菌病是由鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)引起的的一种主要侵害雏鸭、雏火鸡等多种禽类的急性或慢性传染病。该病的发病率和死亡率较高,已成为目前危害世界各国养鸭业最为严重的传染病之一,给养鸭业造成了巨大的经济损失。RA现已发现21个血清型,各血清型之间很少有交叉保护性;对于已感染RA的鸭群,经常用药易产生耐药菌株。因此,建立快速检测RA的方法、了解RA血清型的变化趋势以及开展RA疫苗方面的研究,对于该病的有效防制是十分必要的。本研究根据RA 16S rRNA基因序列设计一对RA特异性引物,成功地建立了检测RA的PCR方法,特异性强,同时该PCR方法能检出20 pg的RA DNA,灵敏度高,这为RA的检测提供了一种快速、敏感、特异性强的检测方法。应用该PCR方法对病料组织直接进行RA检测,脑组织为首选检测对象,具有良好的实际应用意义。利用常规方法和建立的PCR方法对安徽省滁州市、六安市、安庆市、合肥市、巢湖市和蚌埠市六个地区108份病/死鸭进行RA检测,六个地区均检测出RA,阳性检出率为24.07%(26/108),其中滁洲市RA分离株占总分离株的57.69%(15/26),显示安徽地区RA的感染较为普遍,滁洲地区感染情况严重。26株RA分离株中20株为血清1型,占总分离株的76.92%,6株未定型,表明安徽省目前至少存在两种不同的血清型,而2000年以前的分离株均属血清1型,说明安徽省RA流行菌株的血清型存在动态变化,血清型呈现多极化的趋势。对安徽省RA分离株的16S rRNA基因和cam基因进行扩增和序列测定,并与国内外参考菌株进行同源性比较,结果表明不同血清型、同一血清型的不同菌株之间及不同地区的菌株之间16S rRNA基因序列无明显差异,RA 16S rRNA基因核苷酸序列差异的距离与地理分布、菌株来源无一定的相关性;不同毒力株之间cam基因并无明显差异,根据cam基因无法判断不同菌株的毒力强弱。通过动物回归试验,测定8株RA分离株的毒力,其中CZ9和AQ2为弱毒菌株,CZ1、AQ1、LA4为中等毒力菌株,CZ2、CZ12、HF1为强毒菌株。将CZ9和AQ2免疫鸭,CZ9对CZ12和HF1攻击的保护率分别为60%和80%,比AQ2的免疫原性好,故将其作为弱毒疫苗株的候选株,进一步测定CZ9的最佳免疫剂量为8.0×10~8CFU/0.1mL,从而为RA弱毒疫苗的研制提供了一定的基础数据。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 文献综述
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 病料来源
• 2.1.2 主要培养基
• 2.1.3 试验动物
• 2.1.4 参考菌株
• 2.1.5 主要试剂及配制
• 2.1.6 RA16S rRNA基因PCR特异性引物
• 2.1.7 RA16S rRNA基因PCR通用引物
• 2.1.8 RA cam基因PCR引物
• 2.1.9 细菌微量生化反应管
• 2.1.10 RA 1型阳性血清
• 2.1.11 抗生素药敏试验纸片
• 2.1.12 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 鸭疫里氏杆菌的分离培养
• 2.2.2 鸭疫里氏杆菌PCR方法的建立
• 2.2.3 鸭疫里氏杆菌分离株生化试验鉴定
• 2.2.4 鸭疫里氏杆菌分离株运动性试验
• 2.2.5 鸭疫里氏杆菌分离株血清型鉴定
• 2.2.6 鸭疫里氏杆菌分离株16S rRNA基因扩增与测定
• 2.2.7 鸭疫里氏杆菌分离株动物回归试验
• 2.2.8 鸭疫里氏杆菌分离株cam基因的扩增与测定
• 2.2.9 鸭疫里氏杆菌分离株的药物敏感性试验
• 2.2.10 鸭疫里氏杆菌分离株生长曲线的测定
• 2.2.11 鸭疫里氏杆菌分离强毒株的半数致死量测定
• 2.2.12 鸭疫里氏杆菌分离弱毒株的免疫保护试验
• 3 结果
• 3.1 鸭疫里氏杆菌的分离培养
• 3.1.1 RA分离株的菌体形态和菌落培养特征
• 3.1.2 病死鸭的鸭疫里氏杆菌分离情况
• 3.2 鸭疫里氏杆菌PCR方法的建立
• 3.2.1 PCR反应条件的优化
• 3.2.2 PCR方法的特异性测定
• 3.2.3 PCR方法的敏感性测定
• 3.2.4 RA分离株PCR方法鉴定
• 3.2.5 临床病料中RA的检测
• 3.3 鸭疫里氏杆菌分离株生化试验鉴定
• 3.4 鸭疫里氏杆菌分离株运动性试验
• 3.5 鸭疫里氏杆菌分离株血清型鉴定
• 3.6 鸭疫里氏杆菌分离株16S rRNA基因扩增与测定
• 3.7 鸭疫里氏杆菌分离株动物回归试验
• 3.8 鸭疫里氏杆菌分离株cam基因的扩增与测定
• 3.8.1 重组质粒的PCR鉴定
• 3.8.2 8株鸭疫里氏杆菌分离株cam基因序列测定
• 3.9 鸭疫里氏杆菌分离株的药物敏感性试验
• 3.10 鸭疫里氏杆菌分离株生长曲线的测定
• 3.11 鸭疫里氏杆菌分离强毒株的半数致死量测定
• 3.12 鸭疫里氏杆菌分离弱毒株的免疫保护试验
• 3.12.1 RA分离弱毒株的初步筛选
• 3.12.2 RA弱毒株最佳免疫剂量的选择结果
• 4 讨论与分析
• 4.1 PCR快速检测鸭疫里氏杆菌的临床应用意义
• 4.2 安徽省部分地区鸭疫里氏杆菌感染情况及其优势血清型
• 4.3 16S rRNA基因在微生物种群分析方面的作用
• 4.4 RAcam基因与RA毒力强弱的相关性
• 4.5 鸭疫里氏杆菌分离株药物感受性分析
• 4.6 制备弱毒疫苗菌株的初步筛选
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 个人简历
• 研究生期间发表的论文