论文题目: 基因工程化的系膜细胞系移植在体外及体内监测急性肾小球肾炎
论文类型: 博士论文
论文专业: 外科学
作者: 孟一曼
导师: 刘永锋
关键词: 核因子,细胞移植,系膜细胞,基因工程,分泌性碱性磷酸酶,肾小球肾炎
文献来源: 中国医科大学
发表年度: 2005
论文摘要: 研究背景与目的肾小球肾炎是慢性肾衰的常见原因之一。目前,没有一种手段能够连续性地、无侵袭性地评估肾小球肾炎。单核巨噬细胞系统在很多种类的肾小球肾炎的发病中都起重要作用。在病理条件下,活化的巨噬细胞释放出一系列的炎症介质,导致肾小球损伤的起始和进展。监测巨噬细胞一系膜细胞间相互作用对于评估肾小球肾炎的活性和明了肾小球损伤的机制是很重要的。我们将κB增强子片段引导的分泌性碱性磷酸酶（SEAP）稳定地导入系膜细胞。本研究的目的在于确定这个建立的系统能否在体外监测巨噬细胞-系膜细胞间的相互作用;将这个系膜细胞系移植到大鼠体内后,它能否在体内监测局部的肾小球炎症。方法克隆系膜细胞系SM43是从雄性SD大鼠的肾小球分离的。动物实验全部采用清洁级成年雄性SD大鼠（日本山梨大学医学部动物部）。主要仪器设备:Gene Light 55荧光照度仪,超净台,CO2细胞孵育器,CR5B2离心机,BAS-2500型放射自显影机,电泳仪。主要试剂有SEAP检测试剂盒,抗-Thy 1.1单克隆抗体1-22-3,pNFκB-SEAP质粒。主要药物有IL-1β、TNF-α和MG132。首先进行转染,将pNFκB-SEAP质粒（5μg）和pcDNA3.1质粒（1μg）转染5×105个SM43系膜细胞。上述质量与0.25M的CaCl2400μl混合,短时间快速振荡,之后与2xBBS400μl混合并振荡30分钟到1小时,直到出现肉眼可见的沉淀物后,在4℃条件下放置约2到3小时。随后将混合液转入上述培养皿内并搅拌。约16小时后,更换培养液;24小时后,用浓度是330μg/ml的G418（一种新霉素）来选择稳定的转染细胞,可引导性最高、背景影响最小的一个克隆被选出,以进行下面的细胞实验。我们将该克隆命名为SM/NFκB-SEAP5。使用同样的方法,用pSEAP2-对照质粒和pcDNA3.1质粒,我们又建立了SM/SV-SEAP28细胞系。pSEAP2-对照质粒编码SV40早启动子和增强子引导的SEAP。本实验仅使用稳定转染的20代到35代细胞。建立大鼠肾炎模型:在成年雄性SD大鼠（体重250-300克）,将1ml单克隆抗体1-22-3经尾静脉注入,建立抗-Thy 1.1肾小球肾炎模型。筛网法分离肾小球:将正常大鼠或肾炎大鼠（抗体注入后第4天）的肾脏很好地研碎,序列地通过三个不锈钢筛网,筛网的孔径直径分别是180、125、106μm,然后用0—4℃PBS收集肾小球。细胞移植:1×106个已经贴壁生长的SM/NFκB-SEAP5细胞被胰蛋白酶解离,放在1ml含1%FBS的培养液内,4℃放置。大鼠右侧卧位,经左侧腹壁打开腹腔,分离出肾门血管,经左肾动脉将细胞注入到正常或肾炎大鼠（肾炎后第一天）的肾脏内。肾小球肾炎的体内监测:将大鼠分为5组:1.正常大鼠、2.移植了感受细胞的正常大鼠、3.肾炎大鼠、4.移植了感受细胞的肾炎大鼠、5.腹膜细胞移植组。第1、3、6、8和10天从尾静脉采血,然后分离血清,做SEAP分析。每组至少有4—6只大鼠。实验一首先用免疫荧光方法判定细胞的特性;然后体外实验观察该细胞系监测巨噬细胞-系膜细胞间的相互作用情况。主要用SEAP活性测定法检测培养液中SEAP活性,Northern测定SEAP mRNA水平。实验二采用基因工程化的感受细胞系移植,在体内监测急性肾小球肾炎。主要用SEAP活性测定法检测血清和培养液中SEAP活性,Northern测定SEAP mRNA水平。实验三以实验一及实验二的特殊发现为依据,利用共培养实验和交互饲育实验探求NF-κB信号途径在体外培养的正常肾小球是否自发性地活化,以及MAPK与NF-κB信号活化的关系。统计学处理:以3孔细胞或4孔细胞为一组进行分析。大鼠分组则是4到6只为一组。资料的表示方法是平均值±标准误。用非参数性Mann-Whitney U检验进行统计学分析。认为p<0.05具有统计学意义。结果实验一:建立的感受细胞在接受系膜细胞标记物抗α平滑肌肌动蛋白单克隆抗体（1:100）染色和抗Thy 1.1单克隆抗体（1:100）染色时,呈阳性。在前炎性因子IL-1β刺激感受性系膜细胞时,Northern分析和SEAP活性测定都表明SEAP水平以时间和浓度依赖的方式增加。不同于κB增强子片段的刺激物IL-1β和TNF-α,TRE的刺激物TPA、CRE的刺激物forskolin以及SRE的刺激物PDGF-BB都不能诱导出SEAP水平的提高。在暴露于活化的巨噬细胞的感受细胞,Northern可以观察到明显的SEAP mRNA的诱导。同样,可以在两种细胞的共培养液中检测到显著的SEAP活性（有巨噬细胞组80,318±2,365 RLU;没有巨噬细胞组2,075±82 RLU,二者相比有明显统计学差异）。这种诱导可以被NF-κB抑制剂MG132完全抑制（782±141 RLU,与巨噬细胞组相比,也有明显统计学差异）。实验二:荧光显微镜下,通过DiI染色标记的方式,证明:在有感受细胞移植的左侧肾脏分离的肾小球,可以明显地看到感受细胞的积聚;而在没有感受细胞移植的右侧肾脏分离的肾小球,没有看到感受细胞的积聚。具体数据分析是:在有感受细胞移植的左肾,DiI阳性染色的肾小球的比例是90.8±2.9%。在没有感受细胞移植的右肾,观察不到阳性染色的肾小球,二者有明显统计学差异。另一个克隆细胞系SM/SV-SEAP28细胞体内移植后,血清SEAP分析显示了血清中的SEAP水平以注入细胞数目依赖的方式升高。这说明SEAP可以在体内被作为一个报告分子,而且可以从血清中检测到。在SM/NFκB-SEAP5细胞移植实验中,血清SEAP在第3到6天达到最高值,随后开始下降（3天时是基础值的3.46±0.44倍,6天时是基础值的3.47±0.85倍）。甚至于在细胞移植第10天以后,也可以从肾小球中再培养出许多新霉素耐受的感受细胞。而且,当向肾炎大鼠腹腔内注射感受细胞时,并不能监测到血清SEAP水平的升高,说明移植的细胞只能监测局部的炎症。如上的结果提示:用一种肾小球局部存在的生物感受系统选择性并持续性地评估肾小球肾炎是可行的。实验三:在体外培养的正常的肾小球,可以发现MCP-1的自发生成。共同培养和交互饲育实验都显示:分离的正常的肾小球自发地产生自分泌/旁分泌因子,促进SM43细胞MCP-1的生成。MG132明显抑制MCP-1的生成。这说明MCP-1的诱导也是依赖于NF-κB信号传导途径的。与SM/NFκB-SEAP5系膜细胞系的共同培养和交互饲育实验都显示:体外培养的肾小球的确产生自分泌/旁分泌因子,这些因子激活NF-κB信号传导系统。当PD098059（50μM,ERK抑制剂）或SB203580（25μM;p38MAPK抑制剂）存在于培养液中时,在感受细胞与肾小球共培养24小时以后,这两种药物都能明显地降低来自于SM/NFκB-SEAP5感受细胞的SEAP的分泌。结论1.我们建立了一个基因工程化的感受细胞系,它可以在κB增强子的引导下,制造和分泌SEAP。当受到巨噬细胞产生的前炎性因子的刺激时,或直接受到活化的巨噬细胞的刺激时,可以观察到SEAP分泌的明显的升高。交互饲育研究表明:在培养液中存在活化的巨噬细胞集聚的炎性肾小球释放的可溶性因子的时候,感受细胞可以分泌SEAP。细胞移植研究表明感受细胞在活化的巨噬细胞存在的炎性肾小球内分泌SEAP。我们的这些数据说明了这个建立的系统可以在体外监测巨噬细胞—系膜细胞的相互作用。2.当建立的系膜细胞系经肾动脉被移植到患有肾炎的大鼠体内后,血清SEAP水平明显升高。血清SEAP的动态变化与肾小球肾炎的活动程度明显相关,在药物干预性治疗后血清SEAP水平下降。总之,在体内用基因工程化细胞为基础的生物感受系统可以监测急性肾小球肾炎。3.首次发现并确定:另一个调节许多细胞功能的信号传导途径—NF-κB信号传导系统,在体外培养的肾小球也可以自发激活,而且不需要其他外源的刺激。自发的NF-κB信号传导系统的激活是由体外培养的肾小球产生的自分泌/旁分泌因子介导的;MAKP信号途径对于产生NF-κB刺激因素是至关重要的。
论文目录:
一、摘要
1.中文论著摘要
2.英文论著摘要
二、英文缩略语
三、论文
论文一 在体外用系膜感受细胞系实时监测系膜细胞—巨噬细胞间的相互作用
1.前言
2.实验材料与方法
3.实验结果(附论文图片)
4.讨论
5.结论
论文二 在体内用基因工程化的细胞为基础的生物感受系统监测急性肾小球肾炎
1.前言
2.实验材料与方法
3.实验结果(附论文图片)
4.讨论
5.结论
论文三 NF-κB信号途径在分离的肾小球的自动激活:MAPK的作用
1.前言
2.实验材料与方法
3.实验结果(附论文图片)
4.讨论
5.结论
四、本研究创新性的自我评价
五、参考文献
六、附录
1.综述
2.在学期间科研成绩
3.致谢
4.个人简介
发布时间: 2008-04-24
参考文献
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