D-氨基酸氧化酶基因的诱导表达及酶工程的研究

论文摘要

本文利用乳糖代替IPTG作为诱导剂,对含有D-氨基酸氧化酶（DAAO）基因的重组大肠杆菌BL21（DE3）/pWY中的DAAO进行诱导表达。通过摇瓶发酵,初步研究了乳糖浓度、菌体浓度、诱导温度、诱导时间对DAAO表达的影响,结果表明:当菌浓OD600达1.0左右、乳糖浓度为10g/L、28℃下诱导约6h,摇瓶发酵得到的DAAO酶活高达2400U/L。在5L自控式发酵罐上进行表达时,对其高密度发酵的诱导温度进行了进一步优化,分别在23℃、25℃、28℃、32℃和37℃下进行乳糖诱导表达,通过pH控制,葡萄糖消耗结束后,开始降温并分两次补加乳糖进行诱导,在28℃乳糖浓度1%诱导发酵约22h,酶活最高达3784.32U/L,菌浓（OD600）达27.44。并且利用本实验室自制的金属螯合载体EPI-30-ARG-IDA-Co2+对这种带有6个组氨酸的重组D-氨基酸氧化酶（DAAO）进行一步分离纯化,其纯化倍数为10倍,酶活回收率达38.35%,SDS-PAGE显示为单一条带,纯酶液经环氧载体Eupergit C固定化处理后,其最适反应温度提高到40℃、最适反应pH向碱性偏移,固定化酶对温度和pH的稳定性提高,表观米氏常数增大。固定化酶活力回收达到42.44%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 D-氨基酸氧化酶的研究进展
• 1.1.1 D-氨基酸氧化酶的来源及其在自然界的分布
• 1.1.2 D-氨基酸氧化酶的生理功能及生物学特性
• 1.1.3 D-氨基酸氧化酶的结构特性
• 1.1.4 D-氨基酸氧化酶的热稳定性和pH稳定性
• 1.1.5 D-氨基酸氧化酶的催化机理
• 1.1.6 D-氨基酸氧化酶的底物特异性
• 1.1.7 三角酵母的D-氨基酸氧化酶
• 1.1.8 D-氨基酸氧化酶的基因克隆和序列分析
• 1.2 D-氨基酸氧化酶基因的表达
• 1.2.1 大肠杆菌（Escherichia coli）
• 1.2.2 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）
• 1.3 D-氨基酸氧化酶的应用
• 1.4 展望
• 第二章 实验材料、仪器和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种及培养基配方
• 2.1.2 抗生素溶液的配制
• 2.1.3 固定化材料
• 2.1.4 化学药品
• 2.2 仪器与设备
• 2.3 分析方法
• 2.3.1 菌体浓度的测定
• 2.3.2 D-氨基酸氧化酶（DAAO）活力测定
• 2.3.3 蛋白质浓度测定
• 第三章 D-氨基酸氧化酶基因的诱导表达条件优化
• 前言
• 3.1 材料
• 3.2 实验方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 重组质粒的gel图
• 3.3.2 daao基因的PCR扩增
• 3.3.3 正交实验结果分析
• 3.3.4 乳糖诱导的单因素条件优化
• 3.4 结论
• 第四章 D-氨基酸氧化酶基因工程菌高密度培养
• 前言
• 4.1 材料与仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 菌种活化
• 4.2.2 种子液
• 4.2.3 发酵罐上工艺优化
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 诱导温度为23℃下高密度发酵的菌浓和酶活
• 4.3.2 诱导温度为25℃下高密度发酵的菌浓和酶活
• 4.3.3 诱导温度为28℃下高密度发酵的菌浓和酶活
• 4.3.4 诱导温度为32℃下高密度发酵的菌浓和酶活
• 4.3.5 诱导温度为37℃下高密度发酵的菌浓和酶活
• 4.4 结论
• 第五章 D-氨基酸氧化酶的分离纯化
• 前言
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 超声破壁最适时间的选择
• 5.2.2 载体投入不同比例对酶与载体吸附效率的影响
• 5.2.3 纯化D-氨基酸氧化酶SDS-PAGE图谱
• 5.3 结论
• 第六章 D-氨基酸氧化酶的固定化研究
• 前言
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 方法
• 6.2 结果与讨论
• 6.2.1 D-氨基酸氧化酶的固定化效率
• 6.2.2 最适反应温度的确定
• 6.2.3 pH对酶活力的影响
• 6.2.4 固定化酶的热稳定性
• 6.2.5 固定化酶的pH稳定性
• 6.2.6 DAAO米氏常数的测定
• 6.3 结论
• 第七章 论文总结
• 7.1 论文创新点
• 7.2 论文后续工作与展望
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士期间的研究成果