论文摘要
1.背景与目的:2型糖尿病是一种主要由于胰岛素抵抗伴随相对胰岛素不足,或胰岛素分泌缺陷伴有或不伴有胰岛素抵抗而导致慢性高血糖的代谢疾病,占糖尿病总数的90%-95%。2型糖尿病的重要原因之一是由于激素调节紊乱所致的饮食不当而产生的,因此可卡因-苯丙胺调节转录肽（cocaine- and amphetamine-related transcript peptide, CART）在调控进食行为和体内能量平衡方面的作用受到广泛关注。CART分布在许多与进食等相关的脑区,尤其是在下丘脑背内侧核（dorsomedial nucleus,DMH）、腹内侧（ventromedial nucleus,VMH）、弓状核（areuate nucleus,ARC）、外侧下丘脑（1ateral hypothalamus,LH）和室旁核（paraventricular nucleus,PVN）中分布较多。下丘脑不同核团之间构成复杂的调控网络,通过分泌神经递质以及神经元间的投射通路在机体摄食活动和能量平衡调节活动中发挥重要作用。研究表明CART与某些神经递质共存于某些神经元,提示CART参与调节进食行为。CART除了在中枢和外周神经系统中分布外,外周组织也有分布如交感节前神经纤维、胃窦G细胞、胰岛生长抑素细胞（islet somatostatin cells）、肠肌丛等,表明CART是一种脑肠肽,在胃肠道及中枢、外周神经系统中均能发挥作用。上述研究表明CART作为内源性神经递质,在奖赏与强化、食欲、应激、感知、内分泌等生理过程中发挥重要的作用。因此在本课题中,我们将从整体动物和和细胞水平探讨CART在2型糖尿病大鼠下丘脑及胰岛β细胞中的表达及其作用机制。期望为深入认识CART的生物学功能及其调控机制提供新的实验依据,对CART的深入研究将使CART可能成为基因治疗2型糖尿病的新药物靶点。2.方法:2.1 2型糖尿病大鼠模型的建立及血中FBG、TC、TG、FFA和FINS的检测大鼠高脂饲料喂养4周,禁食12h后腹腔注射链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ） 35mg/kg,用于建立2型糖尿病模型,正常对照组大鼠腹腔注射等体积的柠檬酸缓冲液。1周后,挑选空腹血糖值≥16.7 mmol/L作为糖尿病模型大鼠。建模前、后,按相应方法进行血中空腹血糖（fasting blood glucose, FBG）、三酰甘油（Triglyceride, TG）、总胆固醇（Total cholesterol, TC）、游离脂肪酸（Free fatty acid, FFA）、血清胰岛素（fasting insulin levels, FINS）等指标的检测。2.2观察CART对2型糖尿病大鼠下丘脑定位核团进食量的影响及饮食干预对CART mRNA的表达使用脑立体定位仪结合大鼠脑图谱,按照各核团三维坐标,进行准确定位。术后给予大鼠抗感染措施,恢复7d后进行实验,并在实验结束后,对导管植入位置进行尼森染色确定定位结果的准确性。使用微量注射器将各浓度CART注射入禁食各实验组的ARC、DMH及PVN核团中,或不禁食各实验组的ARC核团中,药物注射后1,2,4,8,24h测定进食量。采用荧光实时定量PCR观察饮食干预后糖尿病大鼠ARC中CART mRNA的水平变化。2.3探讨神经肽Y（NPY）与CART对进食行为的调节及CART对其他神经递质释放的影响使用微量注射器将CART或NPY注射入禁食各实验组的ARC核团中,药物注射后1,2h测定进食量。采用免疫荧光双标分析糖尿病大鼠PVN核团中NPY、CART的表达。通过下丘脑脑片孵育,放免法测定CART对下丘脑重要神经递质NPY、AGRP、CRH和α-MSH的释放。2.4探讨PKA/CREB信号通路在糖尿病大鼠ARC中的作用采用原位杂交和Western blotting技术,在2型糖尿病大鼠ARC内探讨PKA/CREB参与CART mRNA和蛋白的转录调节中的作用。2.5探讨钙离子内流激活的ERK信号通路在CART调节下丘脑神经元磷酸化中的作用首先对大鼠下丘脑神经元进行培养,通过Western blotting分析ERK1/2和磷酸化ERK1/2的蛋白表达,用Fluo-3/AM钙荧光探针标记细胞内游离Ca2+,激光共聚焦测定神经元[Ca2+]i的变化研究CART对ERK1/2信号通路的调节。2.6探讨CART在体外细胞模型和2型糖尿病大鼠胰岛β细胞中的表达及作用机制培养大鼠胰岛β细胞瘤细胞INS-1,观察CART对INS-1细胞胰岛素分泌的影响。研究CART对分离、纯化后的糖尿病大鼠胰岛细胞胰岛素分泌的作用。通过免疫荧光、超薄切片结合胶体金标记蛋白A免疫电镜技术（PAg）研究CART在2型糖尿病大鼠胰岛β细胞中的作用。通过大鼠口服葡萄糖耐量实验（OGTT）研究磷酸西他列汀对糖尿病大鼠血糖、胰高血糖素样肽（GLP-1）、胰岛素的影响,以及CART在磷酸西他列汀治疗糖尿病发生发展中的作用。3.结果:3.1 2型糖尿病大鼠模型的建立及血中FBG、TC、TG、FFA和FINS的检测糖尿病模型大鼠血中FBG、TG、TC、FFA均较正常对照大鼠明显增加,而FINS含量较正常对照大鼠明显降低,表明本研究建立的2型糖尿病大鼠模型符合要求。3.2 CART对2型糖尿病大鼠下丘脑定位核团进食量的影响及饮食干预对CART mRNA的表达在禁食糖尿病大鼠PVN中,仅注射高浓度CART可以促进糖尿病大鼠2-4h的进食;在禁食糖尿病大鼠ARC和DMH中,注射CART可以促进糖尿病大鼠的进食（0-1,1-2h）;在4-8h出现进食量下降（i-ARC）;在不禁食糖尿病大鼠ARC中,与禁食大鼠整体比较,进食量明显增高,且高脂饮食可以促进糖尿病大鼠进食量增高。QRT-PCR结果表明,高脂饮食糖尿病大鼠ARC中CART mRNA表达增高,进一步说明CART应对高脂饮食时可能有特殊的方式。3.3 NPY与CART对进食行为的调节及CART对其他神经递质释放的影响ARC内微量注射NPY对进食普通和高脂饲料的糖尿病大鼠进食量并无明显区别。ARC内微量注射CART对进食普通和高脂饲料的糖尿病大鼠进食量明显区别。碳水化合物在普通饲料和高脂饲料中的比例为3:1,在NPY引起的摄食增加中,增加碳水化合物的摄入是最主要的。糖尿病大鼠进食高脂饲料2周后,先注射0.2 nmol CART 10min后注射0.2 nmol NPY,与单独注射NPY及普通饲料喂养2周后的CART+NPY其进食量明显增高,表明CART对高脂饮食有反应而NPY对碳水化合物有反应,再次说明了CART在应对高脂饮食时可能有特殊的方式。免疫荧光结果显示NPY和CART蛋白在2型糖尿病大鼠下丘脑PVN核团中广泛分布,且大量表达,具有一定的共表达,糖尿病大鼠PVN内可能存在CART→NPY联系。下丘脑脑片释放实验结果表明,0.4,4,40 nmol/L CART灌流脑片后,NPY-IR升高,4nmol/L CART灌流后明显促进AGRP-IR和CRH-IR的释放（p<0.05）,α-MSH-IR各组间无明显差异,CART可能刺激下丘脑促食欲神经递质的释放。3.4 PKA/CREB信号通路在糖尿病大鼠ARC中的作用通过原位杂交检测到PKA激动剂forskolin增加ARC核团CART mRNA表达,呈剂量依赖性;PKA抑制剂Rp-cAMPs减少ARC核团CART mRNA表达,两者联合注射可减弱由forskolin引起的CART mRNA释放,这些结果表明PKA信号通路在CART基因表达的调节中具有重要作用。Western blotting显示ARC注射forskolin后,CART蛋白表达增高,含量明显高于对照组,Rp-cAMPs减弱由forskolin介导的CART蛋白表达,此结果与基因转录结果一致（P<0.05）。ARC注射forskolin后,增加磷酸化CREB（p-CREB）蛋白表达,含量明显高于对照组,注射Rp-cAMPs后降低p-CREB蛋白表达,含量明显低于forskolin组,Rp-cAMPs减弱由forskolin介导的CREB磷酸化。3.5钙离子内流激活的ERK信号通路在CART调节下丘脑神经元磷酸化中的作用3.5.1下丘脑神经元鉴定培养的神经元生长迅速,胶质细胞少,4-6d神经元形态饱满,胞体直径,突起长度,均达高峰,且无过于广泛的突触连接和胶质细胞生长。经NF-200染色后计算培养神经元的纯度达96.17±0.06%。3.5.2 CART对下丘脑神经元ERK1/2磷酸化的调节Western blotting显示,CART能特异性引起下丘脑神经元快速和持续的ERK1/2磷酸化反应,并呈剂量（1-100nmol/L）、时间（5-90min）依赖关系。MEK的拮抗剂U0126抑制正常的ERK1/2磷酸化并阻断由CART诱导的ERK1/2磷酸化。3.5.3 CART促进下丘脑神经元[Ca2+]i升高D-hank’s液和DMSO作为阴性对照不能影响下丘脑神经元内游离钙的水平,100nmol/L CART刺激培养的下丘脑神经元,会导致绝大多数神经元内[Ca2+]i迅速上升并稳定在一个较高的水平,或以较高的浓度水平为中心,反复轻微振荡,MEK阻断剂U0126预处理神经元后,100nmol/L CART不再能够引起下丘脑神经元内[Ca2+]i下降,说明ERK1/2信号途径参与了CART激活细胞内[Ca2+]i的过程。3.6 CART在体外细胞模型和2型糖尿病大鼠胰岛β细胞中的表达及作用3.6.1 CART对INS-1细胞胰岛素分泌的影响培养的INS-1细胞密度在l×106/ml以上,呈扁平不规则多角形。GLP-1能促进INS-1细胞胰岛素和cAMP的释放,在GLP-1的高糖溶液中加入CART后,能增强GLP-1对INS-1细胞胰岛素和cAMP的释放。3.6.2胰岛细胞灌注后CART对GSIS的影响每只大鼠分离纯化后获得的胰岛数量为303±44个,DTZ染色显示胰岛纯度>85%,AO-PI染色显示胰岛存活率>95%。在含有GLP-1或GLP-1+CART的高糖中加入PKA抑制剂H89后,与对照组、GLP-1组和GLP-1+CART组比较,INS的释放降低。3.6.3磷酸西他列汀对糖尿病大鼠OGTT期间血糖、GLP-1、血清胰岛素的影响糖尿病模型大鼠糖耐量严重受损,口服灌胃磷酸西他列汀能显著提高大鼠糖耐量水平,并呈剂量依赖性。磷酸西他列汀低、中、高剂量组AUC与正常组和模型对照组AUC比较能显著增加血浆GLP-1水平,并呈剂量依赖性。糖尿病模型组大鼠血清中胰岛素水平与正常对照组大鼠比较明显降低;磷酸西他列汀各组大鼠血清中胰岛素水平较糖尿病模型组和正常大鼠组明显升高,并呈剂量依赖性。3.6.4磷酸西他列汀对2型糖尿病大鼠胰岛病理结构的影响HE结果显示,和正常对照组大鼠比较,糖尿病模型组大鼠胰腺中胰岛面积明显减小和胰岛β细胞数量明显减少。中、高剂量组大鼠的胰岛面积和胰岛β细胞数量较糖尿病模型组大鼠明显增加和增多,有趋向与正常大鼠水平。3.6.5 CART-IR、Insulin-IR、Glucagon-IR的表达免疫荧光结果显示,正常大鼠CART-IR主要在胰岛δ细胞中表达,胰岛β细胞表达很少,糖尿病模型大鼠CART-IR除了在δ细胞表达外,也在胰岛β细胞中大量表达,中、高剂量组能逐步降低CART-IR在胰岛β细胞中的表达,并呈剂量依赖性。正常大鼠Insulin-IR主要在胰岛β细胞中表达,Glucagon-IR在胰岛α细胞中表达,Insulin-IR和Glucagon-IR几乎没有共表达;糖尿病大鼠Insulin-IR在胰岛β细胞中表达减少,Glucagon-IR在胰岛α细胞中表达增加,有一部分共表达;中、高剂量组能逐步增加Insulin -IR在胰岛β细胞中的表达,减少Glucagon-IR在胰岛α细胞中表达,并呈剂量依赖性。3.6.6 CART在2型糖尿病大鼠胰岛β细胞中的表达应用超薄切片技术的PAg免疫电镜结果显示,糖尿病大鼠胰岛β细胞中CART阳性呈黑色点状颗粒,分布在β细胞细胞核和界膜之间,细胞核内无阳性,阴性对照无CART标记。胰岛δ细胞中CART阳性呈黑色点状颗粒,分布在细胞核内,细胞核和界膜之间无阳性。4.结论:4.1本研究采用高脂饲料喂养加腹腔注射小剂量STZ诱导大鼠的空腹血糖和脂质代谢紊乱,成功复制2型糖尿病大鼠模型。ARC内注射CART1-2h和2-4h后糖尿病大鼠进食量增加,表明CART可能是一种促食欲神经肽。高脂饮食糖尿病大鼠ARC中CART mRNA表达增高,进一步说明CART应对高脂饮食时可能有特殊的方式。4.2 CART与NPY共同完成对进食行为的调节,CART可促进糖尿病大鼠PVN内NPY-IR阳性表达,可能存在CART→NPY联系。CART可能刺激下丘脑促食欲神经递质的释放。4.3 p-CREB可以与CART启动子CRE结合位点结合,PKA/CREB通路可能参与CART mRNA和蛋白的转录调节。4.4 CART能特异地引起下丘脑神经元快速而持续的ERK1/2磷酸化反应,并呈时间和剂量依赖性。CART可能通过胞内Ca2+内流激活ERK1/2,在CART调控下丘脑神经元磷酸化过程中发挥重要作用。4.5离体实验表明CART在INS-1细胞和分离的胰岛细胞中可能通过PKA信号通路产生作用。磷酸西他列汀显著改善糖尿病大鼠糖耐量水平,提高GLP-1、胰岛素水平,并呈剂量依赖性。免疫荧光和免疫电镜结果表明CART在糖尿病大鼠β和δ细胞中表达,进一步证明了CART是一种脑肠肽,在胃肠道及神经系统中均能发挥重要作用。
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