论文摘要
目的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PA）是一种定植于支气管扩张、肺囊性纤维化和慢性阻塞性肺病病人下呼吸道的机会致病菌,可持续刺激宿主免疫反应导致进展性的气道破坏,具有多重耐药的特点,一旦感染,临床治疗十分困难。研究发现,PA可分泌多种毒力因子,导致机体发病。其中大部分PA分泌一种蓝绿色的色素毒素即绿脓菌素（Pyocyanin,PCN）,存在于CF病人痰液中,能够促进炎症反应,干扰呼吸道纤毛功能,在急性侵袭性感染中起重要作用。但其作用机制尚不明确,因此探讨PA及PCN感染宿主的发病机制至关重要。肺泡巨噬细胞是重要的防御细胞及炎症调控细胞,可通过活化NF-κB而启动大量炎症介质、细胞因子等合成介导急性肺损伤。而人髓系白血病细胞系-U937细胞具有单核母细胞和未成熟单核细胞的特征,可被佛波酯（PMA）诱导分化形成单核/巨噬细胞,因此,U937细胞是研究人单核/巨噬细胞分化的较理想模型。PA感染的显著特征是大量中性粒细胞（PMN）s在呼吸道表面聚集,发生严重的炎症反应。IL-6、IL-1β及IL-8为重要的促炎细胞因子和PMNs趋化因子,IL-8释放增加是导致感染肺部PMNs增多最主要的原因。研究表明,PA可分泌多种毒力因子诱导呼吸道上皮细胞及单核细胞释放促炎细胞因子,然而PA活菌及其毒力因子绿脓菌素的体外研究大多集中在气道上皮细胞及中性粒细胞,较少有PCN诱导单核细胞的报告。至于PA活菌及绿脓菌素能否诱导U937细胞产生细胞因子IL-8、IL-6等,细胞内信号传导途径如何?至今仍不清楚。IL-1β是宿主防御病原菌感染机制中起重要作用的前炎症细胞因子,体内研究表明内源性IL-1活性的减少或消失能抑制炎症反应进而抵抗PA引起的肺炎,提示IL-1β可能参与PA的发病机制,然而IL-1β在U937细胞抗PA免疫反应中作用如何?目前尚不明确。因此本研究探讨PA对U937细胞IL-8及IL-6表达的诱导作用及绿脓菌素对IL-8表达的影响及其胞内信号传导通路,并探讨IL-1β在U937细胞抗PA免疫反应中的作用。在此基础上,进一步探讨NF-κB及其诱导的细胞因子在PA感染鼠肺中的表达及二硫代氨基甲酸吡咯烷（PDTC）对其表达的影响,从而为临床治疗提供良好的理论依据。方法实验分体外和体内两部分进行,以U937细胞作为体外细胞模型,SD大鼠作为体内模型进行实验。1、体外部分（1）PA采用标准菌株ATCC27853。通过光分解法从吩嗪N-甲硫酸盐（PMS）中提取PCN,并用反相高效液相色谱仪（HPLC）进一步纯化,获取纯化的PCN。（2）分别用不同浓度的PA活菌{multiplicity of infections（MOI）of PA:U937cells为10:1,20:1及50:1}感染U937细胞或PMA分化的U937细胞,PA感染细胞2h后,收集细胞,提取总RNA,应用RT-PCR法检测细胞IL-8及IL-6mRNA表达。于8、16及24h收集细胞培养上清,ELISA法检测细胞培养上清IL-8及IL-6的浓度变化。（3）应用免疫印记方法检测PA感染U937细胞后NF-κB及I-κB蛋白变化。分别于PA感染前60min以不同浓度的PKC活化抑制剂钙感光蛋白（Cal.C）和NF-κB活化抑制剂PDTC预处理,然后以PA感染U937细胞60min（PA:U937为20:1）,收集细胞蛋白,进行细胞浆和核蛋白的提取,蛋白定量,免疫印记,并观察PKC和NF-κB活化抑制剂对其表达的影响。（4）应用免疫细胞化学方法观察PA刺激U937细胞后NF-κBp65的蛋白表达。（5）分别用不同浓度的绿脓菌素（5、25、50μM）感染PMA分化的U937细胞,于24h收集细胞培养上清,ELISA法检测细胞培养上清IL-8的浓度变化。绿脓菌素分别感染细胞1h、2h,收集细胞,提取总RNA,应用RT-PCR法检测细胞IL-8mRNA表达。（6）应用Western blotting方法观察绿脓菌素（50μM）刺激U937细胞胞内MAPK（p38MAPK和ERK1/2）通路信号分子的动态变化以及NF-κB的蛋白表达,并通过RT-PCR和ELISA方法观察MAPKs抑制剂PD98059和SB203580以及NF-κ3活化抑制剂PDTC对IL-8表达的影响,进一步证实MAPKs及NF-κB信号传导通路是否参与了绿脓菌素诱导U937细胞IL-8的表达。（7）作为阳性对照,IL-1β或TNF-α单独或与绿脓菌素联合作用U937细胞,于2h收集细胞,提取总RNA,应用RT-PCR法检测细胞IL-8 mRNA表达,观察IL-1β或TNF-α与绿脓菌素在刺激U937细胞表达IL-8方面是否具有协同作用。IL-1β与PA联合作用U937细胞,24h后收集培养上清,于ELISA法检测细胞培养上清IL-8的浓度变化,观察IL-1β在PA感染中的作用。2、体内部分随机将72只雄性SD大鼠分为对照组、PA组和PDTC组,每组24只。于对照组和PA组大鼠腹腔分别注射1ml生理盐水,PDTC组大鼠腹腔注射等容积的PDTC200mg.kg-1。乙醚麻醉大鼠,对照组气管内接种磷酸盐缓冲液（PBS）0.2ml,PA组和PDTC组分别接种PA悬液0.2ml（6×108CFU/ml）。按PA刺激后不同时间又分为3、6、16、24h亚组,每亚组6只大鼠。观察大鼠一般状态、肺组织形态学改变、免疫组织化学染色及Western blotting检测肺组织NF-κBp65的蛋白表达、ELISA法检测BALF中IL-8的含量。结果1、体外部分（1）PA可促进PMA分化的U937细胞IL-8及IL-6mRNA表达和蛋白分泌,而且具有明显的量效和时效关系。（2）重组IL-1β可增强PA诱导PMA分化的U937细胞产生IL-8。（3）PA能直接诱导并迅速活化NF-κB,于PA感染后60min I-κB磷酸化、NF-κB活化明显,PKC阻断剂Cal C及NF-κB阻断剂PDTC均能显著抑制NF-κB的活化。（4）PKC阻断剂Cal C及NF-κB阻断剂PDTC均能以浓度依赖的方式抑制IL-8及IL-6的分泌。（5）免疫细胞化学方法检测结果显示:正常时,NF-κBp65蛋白在胞浆均匀分布,胞浆内呈棕色均匀淡染,PA刺激后1h,NF-κBp65被激活转入核内,染色以核明显,给予Cal C和PDTC预处理1h后再给予PA刺激,NF-κBp65重新分布于胞浆,胞核也有一定分布。（6）绿脓菌素可促进PMA分化的U937细胞IL-8mRNA的表达及IL-8的分泌,而且具有明显的量效和时效关系。（7）P38MAPK在加入绿脓菌素后10min表达明显增高,30min达高峰,然后逐渐降低。而10min和30min组分别加入抑制剂SB203580,P38MAPK表达明显被抑制,仅可见少量表达,而总的P38MAPK水平在整个实验期间内无变化。（8）ERK1/2在加入绿脓菌素后10min表达明显增高,30min达高峰,然后逐渐降低。而10min和30min组分别加入抑制剂PD98059,ERK1/2表达明显被抑制,而总的ERK水平在整个实验期间内无变化。（9）NF-κB p65的蛋白表达于绿脓菌素感染后30min明显表达,60min表达最为明显。（10）分别用SB203580抑制P38MAPK通路、用PD98059抑制ERK通路、用PDTC抑制NF-κB p65通路,均能引起抑制剂浓度依赖的IL-8蛋白分泌降低。（11）绿脓菌素与TNF-α或IL-1β单独均能诱导U937细胞表达IL-8,但绿脓菌素与其分别联合未发现具有协同作用。2、体内部分（1）体内动物实验发现,PA组大鼠肺组织明显充血、水肿,大量炎性细胞浸润,PDTC预处理组炎性细胞浸润明显减轻。（2）免疫组化显示3～24h可见NF-κB阳性细胞表达,以3h明显增多。Westernblotting结果显示PA组NF-κB的表达于3 h达高峰。PDTC预处理组较PA组NF-κB表达明显减少（P＜0.01）。（3）IL-8的蛋白分泌于3-24h均增高,IL-8的蛋白分泌量于16h达高峰。PDTC预处理组较PA组明显减少（P＜0.01）。结论1、PA可能通过PKC信号通路促进NF-κB的活化,从而启动IL-8及IL-6的高效表达和分泌,加重炎症反应,IL-1β可能在PA炎症反应和免疫应答中起着重要的调节作用,此项研究可能为预防和控制PA引起机体炎症反应和炎症损伤提供新的思路。2、绿脓菌素与TNF-α或IL-1β单独均能诱导U937细胞表达IL-8。绿脓菌素以浓度和时间依赖的方式感染U937细胞促进IL-8的分泌和mRNA表达,表明绿脓菌素在PA感染中具有重要的致炎作用。MAPKs及NF-κB信号传导通路可能参与绿脓菌素感染U937细胞IL-8的表达。3、NF-κB及其诱导的促炎介质在PA肺炎中发挥重要作用,PDTC可能通过抑制NF-κB的活性减轻PA引起的肺损伤。
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