续随子三个候选内参基因的克隆及液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的表达分析

论文摘要

内参基因即内部参照基因,因其在各组织和细胞中表达相对稳定而常被用作检测基因表达水平变化的参照,目前最常用的内参基因包括Actin、GAPDH、18s rRNA、EF1α等。近年来研究发现,这些常用的内参基因都存在缺陷,在不同类型的细胞和组织中、不同发育时期或不同的实验条件下表达量变化较大,这会严重影响所检测基因表达情况的分析,因此,选择合适的内参基因尤为重要。本研究利用反转录PCR （RT-PCR）和cDNA末端快速扩增技术（RACE）,获得了续随子三个内参基因Actin、EF1α和α-tubulin基因的cDNA序列,并通过实时荧光定量PCR技术筛选出最适合作为内参的基因,作为分析续随子耐盐基因液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因表达的内参,为进一步阐明植物耐盐机制,开发和利用优质耐盐基因资源奠定了前期工作基础。主要研究内容如下：1、利用RT-PCR和RACE技术分别得到续随子三个内参基因Actin、EF1α和α-tubulin的cDNA序列,并对其同源性分别进行分析,结果显示,三个内参基因的氨基酸序列同源性均在95%以上,表明这三个基因均为高度保守的基因。2、通过荧光定量PCR（FQ-PCR）技术,对续随子中三个候选内参基因Actin、 EF1α和α-tubulin进行鉴定,筛选出最合适的内参基因。结果表明,Ac tin基因的稳定性最高,可用作续随子液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因表达分析的内参。3、利用RT-PCR和RACE技术得到续随子液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白cDNA片段,该片段长1334bp,编码447个氨基酸。序列同源性比对分析表明,续随子NHX基因核苷酸序列同源性达到75%以上,说明克隆得到的续随子NHX基因是液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因,其编码蛋白执行将Na+区隔化至液泡的功能。4、以Actin基因为内参,利用FQ-PCR技术分析续随子NHX蛋白在不同组织和不同时间NaCl处理条件下的表达情况。实验表明,续随子NHX基因可能是参与耐盐性的重要因子,为今后利用过量表达NHX基因来改良植物耐盐性,开发优质耐盐种质资源提供了依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 综述
• 1.1 续随子概述
• 1.1.1 续随子的形态特征及生境分布
• 1.1.2 续随子的能源用概述
• 1.1.3 续随子的耐盐机制
• 1.2 内参基因
• 1.2.1 理想内参基因的标准
• 1.2.2 内参基因的选择
• 1.3 RACE技术在植物基因分离中的应用
• 1.3.1 RACE原理
• 1.3.2 传统RACE技术的改进
• 1.3.3 RACE技术在植物基因研究中的应用
• 1.4 实时荧光定量PCR
• 1.4.1 实时荧光定量PCR技术的原理
• 1.4.2 实时荧光定量PCR技术的分类
• 1.4.3 实时荧光定量PCR技术在植物研究中的应用
• 1.5 液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白（NHX）
• 1.5.1 NHX的发现及定义
• 1.5.2 NHX的分子结构和功能
• 1.6 研究目的和意义
• 第二章 续随子三个候选内参基因的克隆
• 2.1 材料与仪器
• 2.1.1 续随子材料及菌株
• 2.1.2 实验仪器
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 营养液与培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 RNA的提取
• 2.2.2 RT-PCR
• 2.2.3 续随子三个候选内参基因中间片段的克隆
• 2.2.4 续随子三个候选内参基因3’RACE
• 2.2.5 续随子三个候选内参基因5’RACE
• 2.2.6 全长序列的鉴定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 RNA的质量检测
• 2.3.2 续随子Actin基因序列分析
• 2.3.3 续随子EF1α基因序列分析
• 2.3.4 续随子α-tubulin基因序列分析
• 2.4 讨论
• 第三章 内参基因的筛选
• 3.1 材料与仪器
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 RNA的提取与RT-PCR
• 3.2.2 三个候选内参基因的引物设计
• 3.2.3 FQ-PCR
• 3.2.4 数据分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 普通PCR预扩增内参基因片段
• 3.3.2 FQ-PCR扩增内参基因片段
• 3.3.3 续随子三个内参基因扩增曲线分析
• 3.3.4 Ct值分析
• 3.3.5 内参基因稳定性分析
• 3.4 讨论
• 第四章 续随子NHX基因的克隆与表达分析
• 4.1 材料与仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 续随子NHX基因的克隆
• 4.2.2 FQ-PCR检测NHX基因的表达
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 续随子NHX基因片段扩增产物的鉴定及序列分析
• 4.3.2 续随子NHX基因荧光定量PCR引物的鉴定
• 4.3.3 续随子NHX基因在不同组织中的表达
• 4.4 讨论
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 研究生在读期间发表论文情况
• 致谢