雷公藤红素对人急性髓系白血病原代细胞增殖和凋亡的影响

论文摘要

背景与目的急性白血病是最常见的血液系统恶性肿瘤,是一组异源性起源的恶性克隆性疾病,年发病率3～4/10万。其中急性髓系白血病约占70%,是成人白血病的主要类型。化疗是目前治疗白血病的主要手段。随着化疗方案的不断改进和新的化疗药物的出现,白血病的预后已有非常明显的改善,但仍然存在白血病耐药及停药后白血病复发等问题,严重影响了病人的生活质量及长期生存。因此,寻找有效的抗肿瘤新药、探索相关治疗新方案具有重要意义。近年来,某些中药及其有效组分因具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用备受关注。雷公藤（TWHF）泛指卫矛科雷公藤属植物,是我国传统中药材之一,具有抗炎、免疫抑制、抑菌和抗肿瘤等多种药理作用。雷公藤红素（celastrol）是从雷公藤的根部分离到的三萜类色素,分子式为C29H38O4,分子量为450。有文献报道,红素不仅具有免疫抑制和抗炎作用,还对多种肿瘤细胞具有显著的体外抑制作用。目前有关雷公藤红素对白血病的研究尚处于基础研究阶段,可见到雷公藤红素用于部分白血病细胞株的报道,而该药用于急性髓系白血病原代细胞的研究国内外罕见报道,有待进一步探索。本研究将雷公藤红素作用于急性髓系白血病原代细胞,观察其在体外对急性髓系白血病原代细胞增殖及凋亡的影响,以探讨应用雷公藤红素治疗白血病的可能性,为临床应用雷公藤红素提供理论依据。方法1.人急性髓系白血病细胞分离与培养采用密度梯度法分离初诊急性髓系白血病患者骨髓单个核细胞,以1×106/ml接种在培养瓶中,37℃、5%CO2条件下RPMI-1640中悬浮培养,2～3天换液一次。取处于对数生长期,细胞活性大于95%的细胞进行实验。2.台盼蓝染色活细胞计数法采用台盼蓝染色进行活细胞计数。取40μl雷公藤红素处理过的急性髓系白血病原代细胞悬液用台盼蓝染色后,然后镜检100个细胞,其中拒染细胞为活细胞,染成蓝色细胞为死细胞,计算出活细胞百分率。3.甲基噻唑基四唑比色法（MTT法）取处于指数生长期的未处理急性髓系白血病原代细胞按1×106/mL接种于96孔培养板,180μl/孔。实验孔红素终浓度分别为1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L和10μmol/L,同时设置不加药物的对照孔和不加药物与细胞的调零孔,均设4个复孔。将培养板放至37℃、5%CO2温箱分别培养3h,6h,12h,24h后,每孔加入MTT 20μl,37℃继续培养4h,离心,弃上清,每孔加入150μl二甲基亚砜（DMSO）,低速震荡,使甲瓒晶体完全溶解,置酶标仪在490nm波长处测定每孔的光密度值（OD）。计算细胞增殖抑制率,并以药物浓度为横坐标,抑制率为纵坐标绘制细胞生长抑制曲线,找出雷公藤红素作用于急性髓系白血病原代细胞的最适时间和最适浓度。4.磷脂酸丝氨酸外翻技术（Annexin V-FITC/PI法）采用Annexin V-FITC/PI流式细胞术法。取终浓度为1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L的雷公藤红素作用于急性髓系白血病原代细胞6h及2μmol/L雷公藤红素作用3h、6h、12h、24h后的急性髓系白血病细胞悬液100μl,分别加入10μl Annexin V-FITC,室温避光10min后加入碘化丙啶染色液5μl,避光反应5min,加入400μl 1×Annexin V-FITC结合液,混匀,立即上流式细胞仪定量检测（一般不超过1h）,试验重复3次。同时以不加Annexin V-FITC及PI的一管作为阴性对照。5.细胞凋亡峰定量分析（PI单染法）采用PI单染法定量分析细胞凋亡峰。取终浓度为1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L的雷公藤红素作用于急性髓系白血病原代细胞6h的细胞悬液,用冰预冷的70%乙醇4℃固定24h,取固定后的细胞用PBS洗涤,加入RNAase 37℃消化30min,再加入PI染液,混匀后4℃避光染色15min。流式细胞仪进行细胞周期分析,低于G1期DNA含量细胞为凋亡细胞,实验重复3次。6.数据统计实验数据采用SPSS 13.0统计软件分析,所有统计结果以均数±标准（（?）±s）表示,多样本均数的比较采用单因素方差分析,α=0.05为检验水准。结果1.不同药物浓度及作用时间与细胞增殖抑制率变化的关系采用MTT比色法检测结果显示:不同浓度雷公藤红素组两两比较,2μmol/L、5μmol/L和10μmol/L的雷公藤红素对急性髓系白血病原代细胞增殖的抑制作用相比,差异无统计学意义（P＞0.05）,与1μmol/L组及对照组相比较,均具有显著性差异（P＜0.01）,最适作用浓度为2μmol/L。不同时间雷公藤红素组两两比较发现,6h、12h和24h时雷公藤红素对急性髓系白血病原代细胞的增殖抑制率相比较,差异无统计学意义（P＞0.05）,与3h时相比较,均具有显著性差异（P＜0.01）,最适作用时间为6h。总的来说,雷公藤红素可抑制急性髓系白血病原代细胞的生长,其作用的最适浓度为2μmol/L,最适时间为6h。2.不同药物浓度及作用时间与细胞凋亡率变化的关系流式细胞术检测结果显示1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L雷公藤红素作用6h,急性髓系白血病原代细胞均可出现凋亡现象,凋亡率分别为（34.03±17.07）%、（49.53±19.84）%、（50.56±15.80）%、（28.28±21.21）%,明显高于不加药物的对照组（4.95±1.85）%（P＜0.01）;2μmol/L、5μmol/L浓度组与其他组比较,差异具有统计学意义（P＜0.05）,二者之间比较,凋亡率无明显差异（P＞0.05）。雷公藤红素10μmol/L浓度组的细胞凋亡率较5μmol/L组明显降低（P＜0.05）。红素浓度为2μmol/L时,作用3h、6h、12h、24h后细胞凋亡率分别为（19.67±0.16）%、（37.44±1.01）%、（40.10±1.42）%、（46.53±0.37）%,各组之间相比较有统计学意义（P＜0.05）。3.流式细胞仪对细胞凋亡峰的定量分析用流式细胞仪PI单染法测定结果显示:1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L雷公藤红素作用于急性髓系白血病原代细胞6h后,均可出现G1亚峰（Apoptosis峰）,凋亡峰定量分析结果分别（19.34±5.28）%、（39.84±9.99）%、（46.40±2.67）%、（32.32±8.42）%,均明显高于不加药物的对照组（P＜0.01）;2μmol/L组和5μmol/L、10μmol/L组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）,与1μmol/L组相比较,差异有统计学意义（P＜0.05）;雷公藤红素10μmol/L浓度组细胞凋亡率较5μmol/L组明显降低（P＜0.05）。结论1.雷公藤红素在（1～10μmol/L）浓度范围内可抑制急性髓系白血病原代细胞的增殖,最适作用浓度为2μmol/L,最适作用时间为6h。2.雷公藤红素在（1～10μmol/L）浓度范围内,可诱导急性髓系白血病原代细胞凋亡,提示诱导细胞凋亡可能是雷公藤红素抗白血病作用的重要机制。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 论文部分 雷公藤红素对人急性髓系白血病原代细胞增殖和凋亡的影响
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附图
• 参考文献
• 综述一 雷公藤红素抗肿瘤研究进展
• 参考文献
• 综述二 雷公藤抗白血病作用研究进展
• 参考文献
• 中英文缩略语
• 致谢