猪气管上皮细胞的永生化及副猪嗜血杆菌对其黏附能力的研究

论文摘要

哺乳动物的气管黏膜上皮细胞（Trachea epithelium cells,TECs）,既是许多病原体作用的靶细胞,也是阻挡病原入侵的一个重要屏障。黏膜纤毛上皮细胞能够清除来自外界的有害物质,比如有毒气体,灰尘,细菌,病毒等等,来使机体免受这些有害物质的侵害。然而,目前STECs（Swine trachea epithelium cells,STECs）分离培养的文献尚不多见。建立STECs体外培养技术可为以STECs为细胞模型的研究提供物质基础。副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis, HPS）是一种NAD依赖型、不运动的革兰氏阴性细小杆菌,属于巴斯德菌科（Pastteurellaceae）嗜血杆菌属（Haemophilus）,常引起猪革拉瑟氏病（Glsser’s disease）,给养猪业造成了重大经济损失。近年来,国外学者利用多种猪的细胞株模型,对HPS的作用机制进行了有意义的探索,但国内尚无相关报道。本文将人端粒酶逆转录酶基因（hTERT）转入猪气管上皮细胞使其永生化,并研究了HPS对猪气管上皮细胞的黏附能力,为进一步研究HPS的作用机制奠定了基础,获得了以下结果。（1）无菌采取初生仔猪气管,采用链酶蛋白酶灌注冷消化法,分离得到纯度非常高的原代STECs。刚分离下来的STECs为亮球形,多呈单个存在,倒置相差显微镜下可见不停摆动的纤毛。（2）分离得到的原代STECs于37℃、5%CO2条件下培养,细胞呈单层贴壁,多边形铺路石状生长。用8型角蛋白间接免疫荧光鉴定,细胞核无特异性荧光,细胞膜有特异性荧光,再结合细胞形态观察,证实分离的细胞确为猪气管上皮细胞。培养的细胞经过差速贴壁法纯化,3 d左右长成单层,在体外连续培养传代至6～8代后,细胞开始衰老和死亡。（3）采用脂质体转染法将pCI-neo-hTERT导入原代培养的STECs。转染48 h后加G418进行抗性筛选1个月后,得到抗G418的阳性克隆,继续扩大培养,再用无限稀释法进行纯化。RT-PCR技术检测到hTERT mRNA在转染细胞中表达,用抗hTERT单克隆抗体进行Western Blot检测到转染细胞中有特异性条带产生,而原代培养的细胞无特异性条带产生。表明外源性hTERT基因在转染细胞中得以表达,并激活了端粒酶活性。目前已传至55代。（4）永生化的STECs在体外长期培养下,单层细胞呈铺路石样,细胞界限明显,存在接触抑制性,绘制细胞活力曲线图,永生化的STECs具有正常的细胞增殖周期,比原代细胞生长活跃。（5）用对数生长期的HPS以不同浓度感染永生化的STECs和猪脐静脉血管内皮细胞,分别作用1 h、2 h、3 h、4 h后,通过革兰氏染色观察HPS对细胞的黏附情况。结果表明,HPS可黏附在上皮细胞和血管内皮细胞表面;HPS对气管上皮细胞有毒性作用,致细胞变性坏死和凋亡;HPS对细胞的黏附力和菌液浓度和作用时间有关系,浓度为1.0×108CFU/mL HPS感染4 h后,黏附效果最好。高倍显微镜下可见大量HPS黏附于猪气管上皮细胞,只有个别HPS黏附于猪血管内皮细胞表面。说明HPS对猪气管黏膜上皮细胞的黏附能力远强于对猪血管内皮细胞的黏附能力,可以利用猪气管黏膜上皮细胞建立副猪嗜血杆菌黏附细胞的模型。综上所述,本研究成功的将人端粒酶逆转录酶基因导入猪气管上皮细胞中,并激活了其端粒酶活性,延长了STECs的体外培养的寿命,已传至55代。进一步观察到HPS对猪气管上皮细胞的黏附能力远强于猪血管内皮细胞,说明可以利用猪气管上皮细胞来建立副猪嗜血杆菌黏附细胞的模型。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 气管黏膜上皮细胞的体外分离培养及其应用
• 1.1 气管的组成
• 1.2 气管的微细结构
• 1.2.1 黏膜
• 1.2.2 黏膜下层
• 1.2.3 外膜
• 1.3 气管的生理功能
• 1.3.1 纤毛生理功能
• 1.3.2 气管黏液和黏附功能
• 1.4 气管黏膜上皮与呼吸道疾病
• 1.4.1 气管黏膜上皮与猪革拉瑟氏病
• 1.5 气管黏膜上皮细胞体外培养的应用
• 1.5.1 检验和开发新药物的模型
• 1.5.2 疾病发病机制的模型
• 1.6 气管上皮细胞的体外培养
• 1.6.1 猪气管上皮细胞分离培养的方法
• 1.6.2 体外培养的气管上皮细胞的形态结构
• 1.6.3 气管黏膜上皮细胞的鉴定
• 第二章 端粒、端粒酶与细胞永生化
• 2.1 细胞永生化
• 2.1.1 永生化的概念
• 2.1.2 永生化的相关方法
• 2.2 端粒、端粒酶
• 2.2.1 染色体末端的复制
• 2.2.2 端粒、端粒酶的结构和功能
• 2.2.3 端粒、端粒酶在细胞永生化中的作用机制
• 2.3 通过转染hTERT 基因而建立的永生化细胞系
• 第三章 副猪嗜血杆菌概述
• 3.1 病原特征
• 3.2 致病机理
• 3.3 HPS 与猪气管上皮细胞共培养和黏附模型的建立
• 试验研究
• 第四章 猪气管上皮细胞的分离培养及生长特性的鉴定
• 4.1 材料
• 4.1.1 动物和组织来源
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 血清
• 4.1.4 羊下丘脑粗提取物
• 4.1.5 胰岛素-转铁因子-硒补充剂（ITS）
• 4.1.6 人表皮生长因子
• 4.1.7 谷氨酰胺
• 4.1.8 抗生素
• 4.1.9 缓冲液
• 4.1.10 消化液
• 4.1.11 免疫组织化学试剂
• 4.1.12 主要仪器设备
• 4.2 方法
• 4.2.1 完全培养液的配制
• 4.2.2 猪气管上皮细胞的分离
• 4.2.3 气管上皮细胞的原代培养
• 4.2.4 气管上皮细胞的传代
• 4.2.5 气管上皮细胞的纯化
• 4.2.6 气管上皮细胞的鉴定
• 4.3 结果
• 4.3.1 细胞的形态和特征
• 4.3.2 气管上皮细胞的鉴定结果
• 4.3.3 细胞生长曲线
• 4.4 讨论
• 第五章 hTERT 基因转染猪气管上皮细胞的研究
• 5.1 材料
• 5.1.1 菌株、细胞与质粒
• 5.1.2 工具酶和试剂
• 5.1.3 主要仪器设备
• 5.2 方法
• 5.2.1 质粒pCI-neo-hTERT 转化、扩增与鉴定
• 5.2.2 pCI-neo-hTERT 质粒转染猪气管上皮细胞
• 5.2.3 RT-PCR 检测永生化细胞中外源性hTERT 的表达
• 5.2.4 Western Blot 检测永生化的细胞中外源性hTERT 蛋白的表达
• 5.2.5 永生化的细胞鉴定
• 5.2.6 MTT 法检测细胞活力情况
• 5.2.7 流式细胞仪检测细胞周期
• 5.3 结果
• 5.3.1 pCI-neo-hTERT 质粒扩增和酶切鉴定
• 5.3.2 G418 对猪气管上皮细胞最佳筛选浓度的确定
• 5.3.3 转染后阳性细胞的获得
• 5.3.4 永生化的细胞hTERT 基因的RT-PCR 检测
• 5.3.5 Western Blot 检测永生化的细胞中外源性hTERT 蛋白的表达
• 5.3.6 永生化的STECs 的鉴定
• 5.3.7 细胞活力曲线
• 5.3.8 细胞周期测定
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 第六章 副猪嗜血杆菌对气管上皮细胞黏附能力的研究
• 6.1 材料
• 6.1.1 菌株、细胞和试剂
• 6.1.2 主要仪器
• 6.2 方法
• 6.2.1 细胞培养
• 6.2.2 细菌培养
• 6.2.3 黏附试验
• 6.2.4 菌液浓度对黏附作用的影响
• 6.2.5 作用时间对黏附作用的影响
• 6.2.6 数据处理分析
• 6.3 结果
• 6.3.1 细胞形态
• 6.3.2 HPS 对气管黏膜上皮细胞和血管内皮细胞的黏附作用
• 6.3.3 黏附力的计算
• 6.3.4 菌液浓度对黏附作用的影响
• 6.3.5 作用时间对黏附作用的影响
• 6.4 讨论
• 6.4.1 HPS 黏附气管上皮细胞模型的建立
• 6.4.2 副猪嗜血杆菌对气管上皮细胞的黏附作用
• 6.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介