论文摘要
第一部分大鼠皮层神经元机械性损伤模型中p75NTR、Bax、Bcl-2和Caspase-3表达及细胞凋亡的研究第一节大鼠神经元体外培养与鉴定、机械性损伤模型的制备及评价[目的]完善大鼠神经元体外培养方法，制备并评价大鼠神经元体外培养机械性损伤模型。[方法]取孕17天Sprague Dawley（SD）大鼠皮层脑组织，进行神经元分离、接种及培养。培养24小时后加阿糖胞苷作用48小时，之后换完全培养基培养至第7天神经元成熟，通过倒置相差显微镜观察细胞形态，神经烯醇化酶（NSE）染色，细胞免疫荧光法进行神经元纯度测定。制作机械性损伤模型：神经元上覆盖与培养板孔大小相当的200目钢网，并在钢网上压上不同重量的钢板，低速自动平衡离心机离心，调整离心速度，使其在30秒达到2000r，然后迅速归零，重复2次。根据不同重量钢板加压（3克、6克、9克）依次分为轻、中和重度损伤组，并取不同时间点观察（15分钟、30分钟、1小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时）。倒置相差显微镜下观察损伤前后神经元细胞形态学变化，行台盼蓝染色，计算细胞存活率，并测量各个时段不同损伤组培养液中乳酸脱氢酶的活性，以评价此模型的合理性和可行性。[结果]神经元体外培养1周，镜下观察见细胞核大，约占胞体容积60％-70％，胞核清晰透亮，圆形或卵圆形，核仁明显，核膜清晰可见，胞体呈多形性，胞质透亮，细胞具有折光性，自胞体伸出较多突起，神经元突起间相互联系，形成复杂的网络结构。根据细胞形态、NSE细胞免疫荧光染色神经元细胞阳性率达90％。机械性损伤模型制备后，倒置显微镜下可见神经元破碎、轴索肿胀、轴索球、轴索部分崩解。台盼蓝染色显示伤后30分钟起，各损伤组较对照组细胞存活率均明显下降，伤后1～48小时，中、重型损伤组细胞存活率较轻型损伤组明显下降。从神经元损伤15分钟后，培养上清液中LDH活性增高。损伤组LDH升高有两个时相，LDH曲线呈双峰型，第一峰在30分出现，第二峰在72小时出现；损伤后相同时间点，损伤组与对照组相比LDH含量均有显著性差异（P<0．001），不同损伤程度组间也存在差异（P<0．05）。[结论]神经元培养纯度达到要求；实验建立的神经元损伤模型操作简便，能较好地模拟脑外伤中细胞损伤过程。第二节流式细胞术测定机械性损伤后神经元细胞凋亡[目的]检测大鼠体外培养神经元机械性损伤后，不同损伤程度、不同时间点神经元的细胞凋亡[方法]根据不同重量钢板加压（3克、6克、9克）依次分为轻、中和重度损伤组，并取不同时间点分组（2小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时）。胰酶消化法收集细胞，Annexin V-FITC／PI双染法进行细胞染色后流式细胞仪上机分析，激发波长为488 nm，每个样本均获取1×105个细胞进行观测，并计算凋亡率。[结果]损伤后神经元细胞的凋亡率明显高于正常对照组神经元。相同时间点不同损伤程度的3组两两比较，损伤程度重的组别又较损伤程度轻的组别显著升高（P<0．05）。损伤后72h凋亡达到高峰，且重度组持续时间更长。根据同等损伤程度不同时间点凋亡率的变化，绘制了损伤后神经元细胞凋亡趋势图。[结论]流式细胞术作为检测早期细胞凋亡的手段具有较高精确性，损伤模型细胞凋亡进程及趋势较好的模拟了脑损伤后神经元凋亡。第三节p75NTR、Bax、Bcl-2和Caspase-3表达及其与凋亡的关系[目的]研究大鼠神经元机型性损伤后p75NTR、Bax、Bcl-2与Caspase-3表达改变及神经细胞凋亡情况，分别探讨他们在神经元凋亡过程中的作用机制及相互作用方式。[方法]依据不同损伤程度、不同时间点分组同上，应用特异性抗体细胞免疫法检测各组别间神经元Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达的差异。应用Western-blot法检测各组间p75NTR蛋白表达水平的差异；Realtime-PCR技术分析各组间p75NTR mRNA表达差异。结合流式细胞仪检测的细胞凋亡率，应用统计学方法分析两者相关性。[结果]机械性损伤各组都有Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白的表达，且不同损伤程度组别间表达水平具有显著性差异。重度损伤组Bax、Caspase-3分别显著高于中度损伤组及轻度损伤组（P<0．05），Bcl-2蛋白表达先短暂升高，2h达高峰，之后逐渐下降；Bax逐渐增高，于24小时达到高峰；Caspase-3表达持续时间较长，48-72h达高峰。Bax／Bcl-2比值曲线与Caspase-3表达曲线及凋亡曲线相似，均在48-72小时达峰值。p75NTR蛋白与mRNA表达相似，均于1小时即有表达，48小时到达高峰，之后逐渐减少。统计学分析结果表明，p75NTR表达、Bax／Bcl-2比值、Caspase-3表达和神经元凋亡密切相关。[结论]p75NTR表达、Bax／Bcl-2比值、Caspase-3表达和神经元凋亡密切相关。p75NTR早期表达可能是神经元损伤后细胞凋亡的因素之一，Bax、Bcl-2、Caspase-3的表达可能与这一过程相关。第二部分1-三氯甲基-1,2,3,4-四氢化-β-咔啉（TaClo）对多巴胺能神经元的毒性作用及机制研究[目的]完善大鼠多巴胺能神经元体外培养方法；研究TaClo对体外培养多巴胺能神经元细胞的毒性作用及其机理。[方法]取孕14天大鼠，干冰处死后，常规消毒开腹，取出胚胎，显微镜下剥离外膜，分离中脑，取其腹侧部分，TryplE消化20分钟后，新生小牛血清终止消化，用1000、200、10微升移液器枪头轻柔吹打后，1000r离心6分钟，弃上清液，加入细胞培养液，细胞计数板计数，按1×105个细胞／孔微岛种植法接种于24孔板内，之后隔天半量换液，继续培养7天至细胞成熟，即为神经元-胶质细胞混合培养。原代神经元培养方法同上，接种24小时后加阿糖胞苷作用48小时，全换液，余者相同。倒置显微镜下观察细胞形态，多巴胺能神经元TH染色计数。第7天细胞换液1ml，各孔加入TaClo，使其终浓度分别为50、100、200、500、1000μM，作用72小时后显微镜下观察细胞形态，细胞TH染色后多巴胺神经元计数、拍照，免疫荧光检测JC-1显示线粒体去极化。原代培养方法同上，以1×106个细胞／孔接种于24孔板内，体外培养7天，待神经元成熟后，实验组分别加入TaClo（终浓度50、200μM），作用1小时、24小时后，刮取细胞，提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度后，调整样本浓度。Western-blot法测p38MAPK及Caspase-3蛋白表达。利用统计学软件SYSTAT 10对实验结果进行统计学分析。[结果]培养7天后镜下观察见细胞核大，胞核清晰透亮，圆形或卵圆形，核仁明显，核膜清晰可见，胞体呈多形性，胞质透亮，细胞具有折光性，自胞体伸出较多突起，神经元突起间相互联系，形成复杂的网络结构。TH染色后，多巴胺能神经元染色阳性，呈棕褐色，胞体轴突清晰。加入TaClo作用72小时后，镜下观察，较对照组，加药组明显可见神经元破碎、轴索肿胀、轴索球、轴索部分崩解。TH染色后计数，多巴胺能神经元数量明显下降。以上检测各实验组数值较对照组均有显著差异，且具有明显的药物剂量依赖性，以200浓度实验组变化最为明显。50μM浓度组诱导的神经死亡率为40％，200μM浓度组诱导的神经死亡率为90％。JC-1荧光染色结果显示实验组均显示线粒体去极化增强。Western-blot结果显示：TaClo作用2个时间点，p38 MAPK、Caspase-3表达增高，表达均具有药物剂量依赖性。[结论]TaClo可以导致多巴胺能神经元凋亡，这一过程是通过线粒体膜电位的去极化，以及活化的p38 MAPK和caspase-3蛋白表达等通路完成的。
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