论文摘要
γ分泌酶为介导阿尔茨海默氏病（AD）病理改变的关键酶之一。本文研究了转运膜蛋白21（TMP21）的γ分泌酶复合物组分的蛋白表达量及酶活性的影响。利用核糖核酸干扰和脱氧核糖核酸超表达二次转染技术（siRNA）干扰TMP21在敲除淀粉样前体蛋白表达基因的小鼠胚胎成纤维细胞系（MEF（KO））中的表达。实验选用空质粒载体为对照。处理转染组（T）和对照组（C）细胞,并收集纯化过程中含γ分泌酶复合物的样本:破碎细胞制备全膜蛋白（C1,T1）:选用CHAPSO进一步溶解后超速离心制备所得蛋白（C2,T2）;用γ分泌酶组分Presenilin-1（PS-1）的特异性抗体免疫沉降C2或T2制备IPC2和IPT2。Western blotting检测γ分泌酶复和物重要组分Nicastrin（NCT）,PS-1以及TMP21蛋白表达量;选用饱和浓度的γ分泌酶底物C99,运用ELISA检测Aβpeptide40和Aβpeptide42的生成总量。研究得到如下结果:1.取新生鼠脑,用CHO溶解hAPP751转基因鼠脑和PS1-/-细胞运用离心,恒温孵育等手段得到淀粉样蛋白前体-C末端片段（APP-CTF）,并运用免疫沉淀（IP）,凝胶过滤-高效液相色谱（Gel-HPLC）,反向高效液相色谱（PR-HPLC）,氨基酸序列分析和质谱（MS）法对APP-CTF的性质进行了研究。研究表明APP-CTF的膜外切割可能存在一种膜外双酶（γ分泌酶和ε分泌酶）切切割机制即可能存在α、β、γ以外的酶切新位点ε。2.分别用早老蛋白（PS）,Nicastrin（NCT）,前咽缺陷蛋白-1（APH-1）,早老蛋白增强子-2（PEN-2）免疫沉淀（IP）跨膜转运蛋白21（Transmembrane Protein21,TMP21）研究在鼠脑和HEK293细胞细胞系的表达差异。并进一步用蛋白质印迹法分析,结果表明TMP21可能与γ-分泌酶的组成成分Nicastrin（NCT）发生作用,对Aβ40和Aβ42的活性有抑制作用。但是具体的结合区域还是不清楚,有待于进一步的研究工作。3.本研究构建了TMP21的干扰载体,经检测干扰载体细胞模型构建成功。进行干扰载体检测时研究发现TMP21干扰后,对PS1复合物的影响较大,对Aβ40的产生有较大提高。4.经TMP21 siRNA处理MEF细胞后,所得样本T1,T2及IPT2所含TMP21的蛋白表达量较相应对照组样本C1,C2和IPC2下降14.8±2.1%,46.5±4.7%及68.9±3.4%,提示转染组MEF细胞中TMP21表达被成功干扰。而转染组和对照组中,构成γ分泌酶复合物的重要组分NCT与PS-1蛋白表达量无明显变化。同时,参照样本C1,C2及IPC2,样本T1,T2及IPT2中所含γ分泌酶活性分别升高13.9%（p=0.24）,87.2%（p＜0.001）,211.4%（p＜0.001）。5.经TMP21 cDNA处理MEF细胞后,所得样本T1,T2及IPT2所含TMP21的蛋白表达量较相应对照组样本C1,C2和IPC2上升16.9±2.1%,上升44.7±4.7%及64.5±3.4%,提示转染组MEF细胞中TMP21表达被成功超表达。而转染组和对照组中,构成γ分泌酶复合物的重要组分NCT与PS-1蛋白表达量无明显变化。同时,参照样本C1,C2及IPC2,样本T1,T2及IPT2中所含γ分泌酶活性分别下降11.6%（p=0.24）,85.1%（p＜0.001）,198.4%（p＜0.001）。6.有上述结论可以得出:TMP21可与PS-1共沉降,提示TMP21为γ分泌酶复合物的组分之一。MEF细胞中,在TMP21低蛋白表达状态下/高表达状态下,γ分泌酶活性升高/减低,且不影响其他组分的表达水平,提示TMP21为γ分泌酶的负调控因子之一。
论文目录
相关论文文献
- [1].脂肪酸跨膜转运蛋白及其表达的调控[J]. 生物技术世界 2012(11)
- [2].保定苜蓿锌离子跨膜转运蛋白的生物信息学分析(英文)[J]. Agricultural Science & Technology 2012(09)
- [3].ABC跨膜转运蛋白介导的癌细胞多药耐药的研究[J]. 口腔生物医学 2016(03)
- [4].益气活血中药脑泰方对脑缺血后海马CA2区铁跨膜转运蛋白表达的调节作用[J]. 世界中医药 2016(04)
- [5].酪氨酸激酶抑制剂逆转肿瘤多药耐药的研究进展[J]. 中国药房 2013(02)
- [6].ABC跨膜转运蛋白基因表达与乳腺癌铂类药物敏感性的相关性研究[J]. 药学与临床研究 2019(02)
- [7].SMR蛋白:一种跨膜蛋白演化研究的模式蛋白[J]. 生命科学 2017(02)
- [8].抗病毒免疫分子IFITMs的研究进展[J]. 病毒学报 2016(04)
- [9].多药耐药相关蛋白及其在肿瘤耐药中的作用[J]. 药学学报 2011(05)
- [10].ABC跨膜转运蛋白超家族研究进展[J]. 口腔生物医学 2016(04)
- [11].去铁酮对脑缺血再灌注大鼠海马区铁跨膜转运蛋白表达的影响[J]. 中国动脉硬化杂志 2018(06)
- [12].慢性阻塞性肺疾病与多药耐药相关蛋白1的相关性研究进展[J]. 安徽医药 2012(05)
- [13].P-糖蛋白分子结构及转运机制[J]. 药物评价研究 2018(01)
- [14].白血病细胞多药耐药逆转方法的研究进展[J]. 药物评价研究 2018(06)
- [15].ABC跨膜转运蛋白外排抑制剂促进药物肠吸收的研究进展[J]. 世界临床药物 2012(03)
- [16].氟对成釉细胞钙稳态的影响及其机制的研究进展[J]. 中国地方病防治杂志 2016(01)
- [17].多药耐药相关蛋白1及其与肿瘤关系的研究进展[J]. 中国临床药理学与治疗学 2014(03)
- [18].三七及单体对P糖蛋白抑制作用的研究进展[J]. 昆明医科大学学报 2013(11)
- [19].siRNA干扰跨膜转运蛋白21的表达对KO小鼠胚胎成纤维细胞γ分泌酶活性的影响[J]. 中国医药生物技术 2008(02)
- [20].新知新讯[J]. 求知导刊 2015(04)
- [21].中药逆转P-糖蛋白介导的肿瘤多药耐药的研究进展[J]. 中国天然药物 2009(06)
- [22].白藜芦醇逆转肿瘤耐药的分子机制研究进展[J]. 基础医学与临床 2016(03)
- [23].抗原处理相关转运体基因多态性与疾病相关性的研究进展[J]. 实验动物与比较医学 2017(03)
- [24].铁跨膜转运蛋白与脑神经疾病的相关性研究进展[J]. 湖南中医药大学学报 2011(11)
- [25].逆转ATP结合盒转运蛋白参与耐药的研究进展[J]. 中国医药导报 2015(06)
- [26].急性早幼粒细胞白血病患者对亚砷酸耐药机制的研究进展[J]. 中国新药杂志 2017(06)
- [27].转运体介导的药物相互作用与临床安全用药[J]. 大连医科大学学报 2012(01)
- [28].2型糖尿病的治疗与GLUT4的关系[J]. 中国临床研究 2013(12)
- [29].弹力纤维假黄瘤1例[J]. 皮肤病与性病 2012(04)
- [30].水通道蛋白在肝胆系统中的生理学研究进展[J]. 肠外与肠内营养 2012(05)
标签：核糖核酸干扰论文; 转运膜蛋白论文; 分泌酶复合物论文; 酶联免疫反应论文; 蛋白质印迹反应论文; 脱氧核糖核酸超表达论文;