论文摘要
丙酸是一种重要的工业产品,目前主要以化学法生产。随着化石原料的资源匮乏,化学品的生物制造越来越重要,丙酸的发酵法生产技术成为研究新热点。谢氏丙酸杆菌（Propionibacterium shermanii）W125是工业化生产腺苷钴胺素(维生素B12)的优秀菌株,该菌株发酵胞内积累腺苷钴胺素的同时胞外积累丙酸和乙酸,由于丙酸产量不足2%,没有提取的经济价值而随废水排放,造成浪费与污染。本课题研究的主要内容就是维持维生素B12发酵产率不变的前提下,提高胞外丙酸的产量,为工业化联产丙酸和维生素B12奠定基础。主要研究成果如下:建立了简便、精确测定丙酸、乙酸和腺苷钴胺素的色谱方法。调查了Propionibacterium shermanii W125的代谢特性,确立了标准化三级发酵操作程序。以谢氏丙酸杆菌W125为出发菌株,经紫外诱变、定向筛选分离获得一株生长快、产酸高、维生素B12产量不降低的耐渗突变菌株W321。研究了P.shermanii W321的批次发酵,结果表明该菌株在葡萄糖6%,玉米浆2.5%（干物质）,磷酸二氢钾0.2%,氯化钴10 mg/L,接种量为20%,培养温度30℃,pH 6.5条件下,发酵周期为66 h,丙酸产量2.87%,维生素B12产量42μg/mL。与W125发酵相比,丙酸产量提高36.7%,发酵周期缩短30 h。研究了补糖工艺对P.shermanii W321产酸的影响:初始葡萄糖6%,发酵48 h、72 h、108 h分别补入3%的葡萄糖,最终产酸达到4.5%,糖酸转化率为30%,湿重为7.82%,维生素B12产量44μg/mL,发酵周期168 h,与批次发酵工艺比,丙酸终浓度提高56.8%、湿重提高11.6%、维生素B12提高4.7%,发酵周期延长102 h。研究了抗渗剂KS对P.shermanii W321产酸的影响,结果表明KS可以明显加速菌体的生长和产酸速率。结合补糖发酵工艺,在含有0.3%KS的条件下,初糖浓度提高到9%,60 h、84 h分别补糖3%,发酵周期114 h。丙酸产量达5.35%,糖酸转化率为36.1%,湿重为9.9%,维生素B12产量达到51μg/mL,发酵周期114 h,与6%初糖的补料发酵工艺比,丙酸终浓度提高了18.9%,糖酸转化率提高20.3%,湿重提高26.6%,发酵周期缩短54 h,维生素B12产量提高15.9%。发酵液经过滤后,菌体沉淀用于维生素B12的提取,过滤上清液经脱色处理后可以得到无色透明的液体,为工业法制备丙酸提供了依据。首次报道了减压条件下,P.shermanii W321的发酵动力学变化,发现,负压（-0.07MPa）发酵细胞生长量和产物合成都降低,从代谢循环途径看,CO2参与了Wood-Werkman途径中由甲基丙二酰CoA转羧酶催化的转羧反应,减压可能降低了发酵液中CO2的水平,影响CO2参与转羧反应,最终使丙酸合成和细胞生长量降低。总之,本实验通过对P.shermanii W125的诱变和对突变株发酵工艺的研究,使丙酸发酵水平由2%提高到5.35%,提高幅度268%,维生素B12由40μg/mL提高到51μg/mL,提高幅度20.7%。本文的研究工作使发酵法生产丙酸并联产维生素B12技术体系进一步成熟。