禽白血病分子诊断及MHC单倍型鸡系对禽白血病的抗性研究

论文摘要

鸡主要组织相容性复合体（Major histocompatablity complex, MHC）基因具有高度多态性,国外大量的研究报道表明不同MHC单倍型的鸡对禽白血病（Avian leukosis, AL）的抗性有显著差异,因此MHC基因逐渐引起了抗病育种专家的高度重视。本研究根据4个位于MHC区域的微卫星位点的基因型,建立了MHC特异单倍型BWEL-SPF近交鸡系G1、G5、G6,并以此为基础,对各鸡系的AL抗性进行了探索,以期建立AL抗性较强和较易感的鸡系。为对BWEL-SPF鸡进行禽白血病病毒（Avian leukosis virus, ALV）的全群普查,本研究针对ALV p27群特异性抗原基因、内源性和外源性ALV的囊膜蛋白（env）基因,设计3对特异性引物,建立了ALV的通用斑点杂交和内外源性ALV的鉴别三重PCR检测方法。为对宿主细胞的病毒载量进行绝对定量分析,根据ALV A亚群的env和鸡β-actin基因设计2对特异性引物和探针,以此建立ALV A、B亚群的二重荧光定量RT-PCR方法。为探索特异MHC单倍型SPF鸡系对ALV A亚群RAV-1毒株的抗性差异,本研究对G1、G5、G6和G8系雏鸡进行了人工感染试验,6羽G8系雏鸡作为对照。攻毒后剖检死亡和迫杀鸡以观察病变,称量各鸡系雏鸡的体重,利用ALV ELISA抗体检测试剂盒对所有雏鸡的血清抗体效价进行定量检测,通过二重荧光定量RT-PCR方法对所有雏鸡的每千万外周血淋巴细胞的病毒拷贝数（病毒载量）进行定量测定。以死亡率、病变指数、体重相对增长率、抗体效价和病毒载量为指标,对各鸡系的AL抗性进行统计学分析。结果表明G5系的病变率和死亡率均明显高于其它攻毒鸡系,G1系最低,而G6和G8系居中。G5系体重增长较慢,而G1和G6系较快;G1系在攻毒后第5周（w）至试验结束,抗体效价一直高于其它鸡系,而G5系则最低,且攻毒后第8 w至11 w和第15 w至18 w,G1系的抗体效价显著高于G5系（P<0.05）;G1系的病毒载量在攻毒后第7 w至15 w,低于其它鸡系,而G5系自攻毒后第9 w至13 w,极显著高于G1系（P<0.01）。G6系的抗体效价居中,而其病毒载量在攻毒后第8 w至13 w显著高于G1系（P<0.05）,攻毒后第14 w至试验结束,其病毒载量高于其它攻毒鸡系。G8系的抗体效价和病毒载量均居中;为研究MHC单倍型鸡系对RAV-1毒株体外感染的抗性差异,对G1、G5和G6系SPF鸡胚进行了人工感染试验,并利用二重荧光定量RT-PCR方法对各鸡系的肝脏病毒载量进行测定,结果表明G1系的平均病毒载量低于G5和G6系。上述研究结果证实了G1系在感染ALV后,死亡率较低,病变轻微,生长发育较快,抗体保护力较强,且病毒的增殖较慢,因而其对AL具有较强的抗性,而相反G5系则较为易感。本研究为禽白血病的分子诊断提供了有效的工具,也为研究鸡MHC多态性与AL的抗病性的关系提供了重要的依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 研究目的及意义
• 1.2 国内外研究现状
• 1.2.1 病毒的发展进程
• 1.2.2 病毒的基因组结构特点
• 1.2.3 病毒的分类特征
• 1.2.4 病毒的亚群特性
• 1.2.5 病毒的流行病学特点
• 1.2.6 AL 的诊断
• 1.2.6.1 病毒的分离与鉴定
• 1.2.6.2 琼脂双向扩散试验
• 1.2.6.3 免疫荧光试验
• 1.2.6.4 双抗夹心ELISA 试验
• 1.2.6.5 间接补体结合试验
• 1.2.6.6 PCR 方法
• 1.2.7 AL 的遗传抗性
• 1.2.7.1 B-F 基因
• 1.2.7.2 B-L 基因
• 1.2.7.3 B-G 基因
• 1.2.7.4 Rfp-Y 基因
• 1.3 研究内容和方法
• 第二章 研究内容
• 2.1 试验材料和方法
• 2.1.1 试验动物、感受态细胞和病毒
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 鸡胚成纤维细胞的制备
• 2.1.5 病毒的增殖和半数组织感染量（TCID50）的测定
• 2.1.6 重组质粒的构建
• 2.1.6.1 引物的设计与合成
• 2.1.6.2 病毒RNA 和鸡胚基因组的提取
• 2.1.6.3 病毒RNA 反转录
• 2.1.6.4 基因的PCR 扩增
• 2.1.6.5 PCR 产物的连接
• 2.1.6.6 转化
• 2.1.6.7 阳性重组克隆的筛选和鉴定
• 2.1.7 斑点杂交检测方法的建立
• 2.1.7.1 地高辛标记探针的制备
• 2.1.7.2 斑点杂交检测方法
• 2.1.7.3 斑点杂交条件的优化
• 2.1.7.4 斑点杂交的特异性试验
• 2.1.7.5 斑点杂交的敏感性试验
• 2.1.7.6 现地应用及其符合性检测
• 2.1.8 内外源性ALV 三重鉴别PCR 检测方法的建立
• 2.1.8.1 三重PCR 反应的优化
• 2.1.8.2 三重PCR 反应的特异性试验
• 2.1.8.3 三重PCR 反应的敏感性试验
• 2.1.8.4 三重PCR 的初步应用
• 2.1.9 A、B 亚群ALV 二重荧光定量RT-PCR 方法的建立
• 2.1.9.1 引物和探针的设计与合成
• 2.1.9.2 RAV-1 和β-actin 基因的RT-PCR 扩增
• 2.1.9.3 RAV-1 和β-actin 基因的克隆
• 2.1.9.4 二重荧光定量RT-PCR 反应的优化
• 2.1.9.5 二重荧光定量RT-PCR 的标准曲线的构建
• 2.1.9.6 二重荧光定量RT-PCR 的特异性试验
• 2.1.9.7 二重荧光定量RT-PCR 和常规RT-PCR 的灵敏度比较
• 2.1.9.8 二重荧光定量RT-PCR 的重复性试验
• 2.1.9.9 二重荧光定量RT-PCR 方法的临床病料检测
• 2.1.10 G1、G5、G6、G8系SPF雏鸡的ALV人工感染试验
• 2.1.10.1 G1、G5、G6、G8 系SPF 雏鸡的攻毒
• 2.1.10.2 临床症状观察及病变指数的测定
• 2.1.10.3 死亡率的测定
• 2.1.10.4 相对体重增长率的测定及动态曲线的绘制
• 2.1.10.5 死亡鸡各组织脏器的PCR 检测
• 2.1.10.6 外周血血清ALV 抗体效价的测定及动态曲线的绘制
• 2.1.10.7 外周血淋巴细胞中病毒载量的测定及动态曲线的绘制
• 2.1.11 G1、G5、G6 系SPF 鸡胚的人工感染试验
• 2.1.11.1 G1、G5、G6 系SPF 鸡胚的攻毒
• 2.1.11.2 各鸡系肝脏细胞中病毒载量的测定
• 2.1.11.3 各鸡系病毒的阳性检测率的测定
• 2.2 试验结果
• 2.2.1 重组质粒的PCR 鉴定
• 2.2.2 重组质粒的测序
• 2.2.3 斑点杂交
• 2.2.3.1 斑点杂交最佳反应条件的确定
• 2.2.3.2 斑点杂交的特异性试验
• 2.2.3.3 斑点杂交的敏感性试验
• 2.2.3.4 现地应用和符合性检测
• 2.2.4 三重PCR 反应
• 2.2.4.1 三重 PCR 的最佳反应条件的确定
• 2.2.4.2 三重PCR反应的特异性试验
• 2.2.4.3 三重PCR反应的敏感性试验
• 2.2.4.4 现地样品的检测
• 2.2.5 二重荧光定量RT-PCR 方法
• 2.2.5.1 RAV-1 和β-actin 基因的重组质粒的PCR 鉴定
• 2.2.5.2 重组质粒的测序鉴定
• 2.2.5.3 二重荧光定量RT-PCR 方法各反应条件的确定
• 2.2.5.4 二重荧光定量RT-PCR 的标准曲线的构建
• 2.2.5.5 二重荧光定量RT-PCR 的特异性试验
• 2.2.5.6 二重荧光定量RT-PCR 和常规RT-PCR 的敏感性试验
• 2.2.5.7 二重荧光定量RT-PCR 的重复性试验
• 2.2.5.8 现地样品的检测
• 2.2.6 G1、G5、G6 及 G8 系雏鸡的人工感染实验
• 2.2.6.1 试验鸡临床症状及病变指数的测定
• 2.2.6.2 死亡率的测定及死亡鸡的剖检病变
• 2.2.6.3 绝对体重和相对体重增长率的测定及动态曲线的绘制
• 2.2.6.4 死亡鸡各组织脏器的PCR 检测
• 2.2.6.5 各鸡系抗体阳性率和抗体效价的测定及动态曲线的绘制
• 2.2.6.6 各鸡系平均病毒载量的测定及动态曲线的绘制
• 2.2.7 G1、G5、G6 鸡系 SPF 鸡胚的人工感染实验
• 2.2.7.1 各鸡系鸡胚肝脏细胞中病毒载量和病毒阳性检测率的测定
• 2.2.7.2 攻毒后各鸡系 SPF 鸡胚的肝脏病毒载量
• 2.2.7.3 攻毒后各鸡系 SPF 鸡胚的病毒阳性检测率
• 第三章 结论与讨论
• 3.1 讨论
• 3.1.1 斑点杂交检测技术在 ALV 临床检测中的应用
• 3.1.2 内、外源性 ALV 鉴别诊断的意义
• 3.1.3 二重荧光定量 RT-PCR 与常规 RT-PCR 方法在检测 ALV 中的比较
• 3.1.4 死亡、病变指数与抗病性的相关性
• 3.1.5 生长发育与抗病性的相关性
• 3.1.6 ALV 在不同组织中的分布与感染时间
• 3.1.7 体液免疫与抗病性的相关性
• 3.1.8 病毒复制与抗病性的相关性
• 3.1.9 G1、G5 和G6 系病毒载量和抗体效价的关系
• 3.2 全文结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介