纳米二氧化硅抗肝癌细胞活性及其机理研究

论文摘要

作为一种结构简单的纳米材料,纳米二氧化硅具有易于合成和进行表面修饰的特点,不仅被广泛地用于工业领域,还被用于诊断、造影和载药等生物医药领域。研究显示,纳米二氧化硅可以诱导一些正常细胞凋亡,从而表现出一定程度的细胞毒性。但是,到目前为止,有关纳米二氧化硅抗肿瘤活性研究还较少。为了研究纳米二氧化硅（SNP）的抗肿瘤活性,本文选用了粒径为7 nm、20 nm和50nm的三种SNP颗粒,以人正常肝细胞L-02作为对照,考察SNP对人肝癌细胞HepG2的细胞毒性。研究结果表明,SNP的抗肿瘤活性与其粒径有直接联系,具有浓度效应和时间效应,20nm的粒子对肝癌细胞活性的抑制作用最强,7nm的次之,50nm的最弱。当20nm的SNP浓度为160μg/ml时,可使HepG2的细胞活性在72h后降为18.5%。但是,SNP对L-02细胞活性的影响较小,只有当20nm和7nm的两种粒子浓度分别达到320和640μg/ml时,细胞活性才分别下降到81%和73%。与L-02细胞相比,20nm的SNP更容易进入HepG2细胞并分布于细胞核内,引起细胞凋亡。随着纳米二氧化硅作用浓度的上升,caspase-3的活性升高,p53表达量上升,Bcl-2以及procaspase-9的表达量下降,而Bax的表达量基本不变。此外,7nm和20nm的SNP可使胞内的活性氧（ROS）水平上升,谷胱甘肽（GSH）水平下降,对细胞产生氧化胁迫。基于以上结果我们推测,SNP导致HepG2细胞发生氧化胁迫,通过线粒体通路的信号途径诱导肝癌细胞发生凋亡。此外,还进一步对20nm的SNP进行改性,调节纳米粒子的表面电位。获得了表面Zeta电位范围为-22.1～+4.16 mV的6种SNP,从中挑选SNP20 （-22.1 mV）、SNP20a （-8.93 mV）、SNP20b （-0.70 mV）和SNP20c （+4.16 mV）四种颗粒,考察它们对人肝癌细胞HepG2的细胞毒性。结果表明,四种二氧化硅颗粒的细胞毒性稍有不同,流式细胞仪实验中发现四种颗粒诱导细胞凋亡的能力也稍有差别。因此推测,纳米二氧化硅颗粒的表面电位值可能与其抗肝癌细胞活性有关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 概述
• 1.2 纳米材料及其应用简介
• 1.2.1 纳米材料简介
• 1.2.2 纳米材料的应用简介
• 1.3 纳米颗粒的生物安全性及细胞毒性研究
• 1.3.1 纳米颗粒的生物安全性研究
• 1.3.2 纳米颗粒的细胞毒性研究
• 1.4 纳米颗粒抗肿瘤活性的研究
• 1.5 纳米二氧化硅及其在生物医药领域的应用
• 1.5.1 纳米二氧化硅简介
• 1.5.2 纳米二氧化硅在生物医药领域的应用研究
• 1.6 本论文的研究目的、内容和意义
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 细胞株
• 2.1.2 纳米二氧化硅
• 2.1.3 生化试剂
• 2.2 仪器与设备
• 2.3 常用试剂及配制
• 2.4 常用方法
• 2.4.1 实验相关器材灭菌
• 2.4.2 细胞培养方法
• 2.4.3 细胞计数方法
• 2.4.4 细胞总蛋白提取
• 2.4.5 Bradford比色法测定蛋白含量
• 2.4.6 蛋白电泳及Western Blotting
• 第3章 纳米二氧化硅特异性抗肝癌细胞HepG2活性研究
• 3.1 概述
• 3.2 实验材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 材料外貌表征TEM
• 3.2.3 材料的FITC荧光标记及在细胞内分布
• 3.2.4 细胞活性MTT实验
• 3.2.5 细胞核染色（DAPI）
• 3.2.6 Annexin Ⅴ-FITC/PI双染色流式细胞仪测试
• 3.2.7 细胞内Caspase-3表达量测定
• 3.2.8 检测Bax、Bcl-2、p53、procaspase-9蛋白表达量变化的Western blotting实验
• 3.2.9 细胞内ROS含量测定——DCFH-DA荧光探针
• 3.2.10 细胞内GSH含量测定
• 3.2.11 统计学方法
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 纳米二氧化硅的外貌表征
• 3.3.2 纳米二氧化硅的细胞毒性
• 3.3.3 纳米二氧化硅对细胞核形态的影响以及在细胞内分布情况
• 3.3.4 纳米二氧化硅诱导HepG2细胞调亡
• 3.3.5 纳米二氧化硅对凋亡相关蛋白的影响
• 3.3.6 纳米二氧化硅对细胞内ROS以及GSH含量的影响
• 3.4 讨论
• 第4章 纳米二氧化硅的表面电位对其抗HepG2细胞活性的影响
• 4.1 概述
• 4.1.1 表面改性简介
• 4.1.2 表面改性方法
• 4.1.3 纳米材料表面改性的研究现状
• 4.1.4 研究内容、目的及意义
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 纳米二氧化硅的表面改性
• 4.2.3 材料外貌表征TEM
• 4.2.4 Zeta电位检测实验
• 4.2.5 细胞毒性MTT实验
• 4.2.6 Annexin Ⅴ-FITC/PI双染色流式细胞仪测试
• 4.2.7 统计学方法
• 4.3 结果
• 4.3.1 改性前后的纳米二氧化硅的Zeta电位表征
• 4.3.2 改性前后纳米二氧化硅的TEM表征
• 4.3.3 细胞毒性MTT实验结果
• 4.3.4 Annexin Ⅴ-FITC/PI双染色流式细胞仪测试
• 4.4 讨论
• 第5章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士研究生期间发表论文