海洋微生物中细菌群体感应抑制因子的筛选与作用机制研究

论文摘要

随着抗菌药物的广泛应用,细菌的耐药性变得越来越严重,已成为全球关注的危害人类健康的重大难题。目前临床上使用的抗生素都是以细菌的蛋白质合成、细胞壁合成、DNA超螺旋等为靶点,通过干扰这些重要生命过程直接杀死微生物或抑制微生物生长来实现抗感染目的的。在这种生存压力下,细菌很容易产生耐药性。显然以传统的靶点和筛选方法获得的抗生素无法从根本上解决细菌的耐药问题。因此,寻找治疗细菌感染的新途径已成为当今生命科学研究的前沿和热点。近几年来,细菌群体感应（Quorum-Sensing,QS）研究的发展,给我们带来了新的机遇和挑战。群体感应是细菌根据细胞密度变化进行基因表达调控的一种群体行为。研究发现,细菌通过群体感应系统调控致病过程的一些重要环节,如致病因子产生、生物膜（Biofilm）形成等。根据美国NIH的调查报告,80%以上的细菌性感染与生物膜有关,而生物膜的形成是细菌产生抗生素耐药性和免疫逃逸的主要原因之一。因此,细菌群体感应系统干扰的研究对于新型抗菌药物的研究与开发具有重要意义。本文以革兰氏阴性菌的酰基高丝氨酸内酯（N-acyl- homoserine lactones, AHL）介导的群体感应系统为靶标,从海洋微生物中筛选群体感应抑制因子,并对其活性和作用机理进行研究。综合利用唯一能源法和报告菌株法,建立了一种从环境微生物中快速、高效地筛选能产生AHL群体感应抑制因子菌株的方法;利用该方法从海洋微生物中筛选得到多株具有AHL降解能力和竞争性抑制AHL群体感应能力的细菌,并对其中活性最高的一株进行了菌种鉴定,命名为Stenotrophomonas sp.A8。构建了菌株A8基因组DNA文库,利用AHL唯一能源培养基从文库中筛选得到一个具有AHL降解活性的克隆,并利用亚克隆试验确定了具有AHL降解酶活性基因的部分读码框;进一步通过反向PCR克隆得到该基因全长序列,最终得到的降解酶AQ1基因序列全长747bp,编码248个氨基酸,分子量为31.2kD。与Pseudomonas aeruginosa中的AHL降解酶PvdQ同源性为12%,与QuiP同源性为13%,可能属于酰氨酶家族。该酶对多种不同碳链长度的AHL分子均具有降解活性,尤其对3OC6HSL降解活性最强。采用层析技术结合多种AHL报告菌株,从A8的发酵液上清中分离纯化了三个具有AHL竞争性抑制作用的化合物,NMR和MS分析表明这三个化合物均为环肽,命名为:CP1、CP2和CP3。这三个化合物都能竞争性抑制AHL分子与其受体的结合;其中,CP2还能够抑制革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌生物膜的形成;同时S.aureus RN4220中QS调控基因agrA、SarA、Hld的定量PCR结果表明,其mRNA转录水平均受到CP2的抑制。因此,CP2的抗细菌生物膜形成作用可能是通过抑制S.aureus RN4220的QS系统来实现的。综上所述,我们建立了一种高效的从环境微生物中筛选产生AHL群体感应抑制因子菌株的方法;从活性菌株Stenotrophomonas sp.A8中克隆了一个AHL降解酶基因,其重组酶具有降解多种不同碳链长度AHL分子的活性,该类型的酶在Stenotrophomonas属细菌中还未见报道;同时还从A8菌株发酵液上清中分离得到三个具有AHL竞争性抑制作用的环肽CP1、2和3,首次发现环肽化合物CP2对革兰氏阳性菌表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌生物膜的形成具有显著抑制作用,并初步证明CP2的抗生物膜作用与QS系统有关。与传统的抗生素的作用机制完全不同,细菌群体感应抑制因子通过干扰细菌的群体感应系统实现抗感染的目的,而不影响细菌的生长,因此不会产生细菌耐药性。群体感应抑制因子作为新一代抗生素,在多个领域具有广泛的应用前景。本研究工作为开发海洋微生物资源和寻找以QS为靶点的新型抗生素奠定了一定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 0.1 细菌耐药性的现状与新型抗生素研究的必要性
• 0.2 QS 现象的提出和研究现状
• 0.3 QS 与生物膜的关系
• 0.4 以细菌群体感应系统为靶点的药物研究现状
• 0.5 QS 拮抗物的筛选方法
• 1 菌株的筛选与鉴定
• 1.1 试剂与仪器
• 1.2 材料
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 唯一能源法初筛
• 1.3.2 报告菌株法复筛
• 1.3.3 菌株 AHL 分泌能力检测
• 1.3.4 AHL 降解酶的酶活检测
• 1.3.5 菌种鉴定
• 1.4 结果
• 1.4.1 产酶菌株的筛选
• 1.4.2 酶活的检测
• 1.4.3 菌株 A8 的菌种鉴定
• 1.5 讨论
• 2 AHL 降解酶的克隆和表达
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 酶和主要试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 基因组 DNA 的提取
• 2.2.2 基因组 DNA 文库构建
• 2.2.2.1 基因组 DNA 的限制型内切酶消化
• 2.2.2.2 酶切片断与载体的连接、转化
• 2.2.3 具有 AHL 降解活性的亚克隆的筛选
• 2.2.4 活性片断的分析
• 2.2.5 反向 PCR 扩增 ORF3 全序列
• 2.2.6 AHL 降解酶的重组表达
• 2.2.7 AHL 降解活性检测
• 2.2.8 AQ1全长基因克隆
• 2.3 结果
• 2.3.1 基因组DNA的提取
• 2.3.2 基因组 DNA 条件酶切
• 2.3.3 具有 AHL 降解活性的亚克隆的筛选
• 2.3.4 序列分析
• 2.3.5 ORF3 的重组表达
• 2.3.6 ORF3 对 AHL 降解活性检测
• 2.3.7 ORF3 全长基因克隆
• 2.4 讨论
• 3 A8 发酵液中群体感应抑制因子的分离、鉴定和活性分析
• 3.1 材料、试剂与仪器
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 试剂和仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 发酵培养
• 3.2.2 活性物质的萃取
• 3.2.3 活性物质的 HPLC 分析
• 3.2.4 活性物质的纯化
• 3.2.5 化合物结构的确定
• 3.2.6 化合物活性测定
• 3.3 结果
• 3.3.1 发酵培养
• 3.3.2 活性物质的萃取
• 3.3.3 活性物质的 HPLC 分析
• 3.3.4 活性物质的纯化
• 3.3.5 化合物结构的确定
• 3.3.6 化合物活性测定
• 3.4 讨论
• 4 环肽的抗感染作用初步研究
• 4.1 仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 环肽对P.aeruginosa PAO1生物膜形成的影响
• 4.2.2 环肽对P.aeruginosa PAO1抗生素敏感性的影响
• 4.2.3 环肽对金黄色葡萄球菌S.aureus RN4220生物膜形成的影响
• 4.2.4 环肽对S.aureus RN4220抗生素敏感性的影响
• 4.2.5 环肽CP2对其它革兰氏阳性菌生物膜形成的影响
• 4.3 结果
• 4.3.1 环肽对PAO1生物膜形成的影响
• 4.3.2 环肽对PAO1抗生素敏感性的影响
• 4.3.3 环肽对S.aureus RN4220生物膜形成的影响
• 4.3.4 环肽对S.aureus RN4220抗生素敏感性的影响
• 4.3.5 环肽CP2对其它革兰氏阳性菌生物膜形成的影响
• 4.4 讨论
• 5 化合物 CP2 抑制 S. aureus RN4220 生物膜形成机理的初步研究
• 5.1 仪器与试剂
• 5.1.1 仪器
• 5.1.2 试剂
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 总RNA提取
• 5.2.2 RNA反转录
• 5.2.3 定量PCR分析
• 5.2.4 环肽CP2对S.aureus RN4220生长过程中Hld基因表达的影响
• 5.3 结果
• 5.3.1 总RNA提取
• 5.3.2 RNA反转录
• 5.3.3 定量PCR分析
• 5.3.4 环肽 CP2 对 S.aureus RN4220 生长过程中 Hld 基因表达的影响
• 5.4 讨论
• 6 总结与展望
• 7 参考文献
• 致谢