飞蝗β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的克隆、表达及功能研究

论文摘要

β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（β-N-acetylglucosaminidase,NAG）广泛分布于细菌、真菌和节肢动物内。昆虫β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶通常由多个基因编码,分别或共同参与几丁质降解、糖聚合物降解及N-糖基化修饰等生理过程。由于几丁质是昆虫不可或缺的组成成分,而其在高等动植物中没有分布,故对参与几丁质降解的飞蝗β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的研究可为飞蝗的防治提供新的靶标和思路。本文的主要研究内容包括：一、飞蝗β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因全长序列的克隆、序列分析及系统进化发育树的构建。搜索飞蝗EST数据库获得ETS序列,经分析为基因的全长序列,据此设计引物,以飞蝗五龄整虫为模板扩增飞蝗β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的全长序列,获得cDNA序列2667bp,其中开放阅读框1845bp,编码614个氨基酸,5’非翻译区（5’-UTR）和3’-非翻译区（3’-UTR）的长度分别为233bp和589bp。构建系统进化树表明该基因属于具有几丁质催化活性的NAG1家族。二、飞蝗β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因LmNAG1的时空表达。运用RT-PCR和Real-time PCR技术对飞蝗β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因在不同龄期、五龄5、6、7天六个不同组织部位、四龄到五龄表皮中的表达进行了分析。结果显示该基因在飞蝗各个龄期均有表达,表达量随龄期递增；不同组织部位分析显示该基因在前后肠表达量最高；四龄和五龄表皮中的表达变化与20-E滴度吻合,在蜕皮前两天表达量最高。三、飞蝗β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因LmNAG1的生物学功能研究。对LmNAG1进行RNA干扰实验,结果表明：二龄和五龄飞蝗若虫注射dsLmNAG1后,目的基因被沉默,在各组织部位的表达量均显著降低,沉默持续时间>72h；注射后的若虫表现为蜕皮时间延迟、新旧表皮无法完全分离而死亡四、飞蝗β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶总酶活的测定分析。对五龄5、6和7天飞蝗不同组织部位及整虫酶活性进行测定;RNA干扰后不同时间点测定β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶总酶活性。结果显示：九龄最后3天该酶活性与其生理过程相关；已获得的LmNAG1基因被沉默后,β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶总酶活性显著下降。综上所述,本文获得的飞蝗β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因在飞蝗生长发育过程中具有重要作用,其生物学功能与飞蝗蜕皮这一生理过程密切相关,该基因的沉默可导致飞蝗因无法完成蜕皮而死亡,且对β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶总酶活性具有显著的影响。该基因对于RNAi介导的飞蝗有效防治具有潜在的应用价值。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1. 飞蝗概述
• 1.1 飞蝗分布、习性及特征
• 1.2 我国飞蝗的为害及治理
• 2. 昆虫几丁质及β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的研究概况
• 2.1 昆虫几丁质概述
• 2.2 昆虫几丁质降解及β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的研究概况
• 3. RNA干扰技术研究概况
• 4. 本文研究的内容及目的
• 第二章 飞蝗β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的克隆
• 1. 实验材料
• 1.1 供试昆虫
• 1.2 供试药品及主要仪器
• 2. 实验方法
• 2.1 PCR引物的设计
• 2.2 总RNA的提取及第一链cDNA合成
• 2.2.1 RNA的抽提
• 2.2.2 RNA的纯化
• 2.2.3 第一链cDNA合成
• 2.3 PCR扩增
• 2.3.1 PCR反应体系
• 2.3.2 PCR反应程序
• 2.4 PCR产物胶回收和纯化
• 2.5 质粒载体连接、转化及细菌培养
• 2.5.1 连接
• 2.5.2 转化
• 2.6 质粒DNA的提取和酶切鉴定
• 2.7 序列测定
• 3 结果与分析
• 3.1 飞蝗β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的序列分析
• 3.2 β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因进化树的构建及分析
• 4. 讨论
• 第三章 β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的组织分布与发育变化
• 1. 实验材料
• 1.1 供试昆虫
• 1.2 供试药品及主要仪器
• 2. 实验方法
• 2.1 飞蝗不同组织部位β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的表达
• 2.1.1 飞蝗β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因表达引物的设计
• 2.1.2 飞蝗组织部位的解剖
• 2.1.3 总RNA提取及第一链cDNA合成
• 2.1.4 RT-PCR分析不同组织部位β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的表达
• 2.1.5 Real-time PCR分析不同组织部位β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的表达
• 2.2 飞蝗不同龄期β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的表达
• 2.2.1 飞蝗不同龄期样本的准备
• 2.2.2 总RNA提取及第一链cDNA合成
• 2.2.3 RT-PCR分析飞蝗不同龄期β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的表达
• 2.3 飞蝗四龄和五龄若虫β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的表达
• 2.3.1 飞蝗四龄和五龄若虫的解剖
• 2.3.2 总RNA提取及第一链cDNA合成
• 2.3.3 Real-time PCR分析四龄和五龄若虫β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的表达
• 3. 结果与分析
• 3.1 飞蝗不同组织部位β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的表达分析
• 3.2 飞蝗不同发育阶段β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的表达分析
• 3.3 飞蝗四龄和五龄若虫β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的表达分析
• 4. 讨论
• 第四章 飞蝗β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的功能分析
• 1. 实验材料
• 1.1 供试昆虫
• 1.2 供试药品及主要仪器
• 2. 实验方法
• 2.1 β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因dsRNA引物的设计
• 2.2 β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因dsRNA的体外合成
• 2.2.1 PCR反应体系
• 2.2.2 PCR反应程序
• 2.2.3 dsRNA体外合成
• 2.3 β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因dsRNA的体外注射
• 2.4 RNA干扰效果的观察及检测
• 2.4.1 RNA干扰后表型的观察
• 2.4.2 RNA干扰后基因型的检测
• 2.4.3 RNA干扰后飞蝗β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶总酶活性的测定
• 3. 结果与分析
• 3.1 飞蝗β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的功能分析
• 3.2 飞蝗β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因干扰效率分析
• 3.3 飞蝗β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因干扰后总酶活性的变化分析
• 4. 讨论
• 第五章 飞蝗β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶总酶活性测定
• 1. 实验材料
• 1.1 供试昆虫
• 1.2 供试药品及主要仪器
• 2. 实验方法
• 2.1 飞蝗不同组织部位的解剖
• 2.2 β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶总酶活性测定方法
• 2.3 4-MU标准曲线的测定方法
• 2.4 BCA蛋白含量测定方法
• 2.5 β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶总酶活性计算方法
• 3. 结果与分析
• 3.1 4-MU标准曲线的绘制
• 3.2 飞蝗五龄整虫β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶总酶活性的测定分析
• 3.3 飞蝗五龄末期不同组织部位β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶总酶活性的测定分析
• 4. 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 攻读学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 个人简历