导读:本文包含了感染性全长克隆论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:猪细小病毒,感染性克隆,遗传标记,致病性
感染性全长克隆论文文献综述
陈松彪,黄勇,童德文[1]（2019）在《携带遗传标记的PPV全长感染性克隆构建及其生物学特性研究》一文中研究指出(目的)猪细小病毒(Porcine Parvovirus, PPV)感染能够突破胎盘屏障引起初孕母猪流产、死胎和木乃伊胎等,严重威胁养猪业的健康发展。PPV基因组全长约5.0 kb,包含两个开放性阅读框(open reading frame,ORF),5′端的ORF1编码3个非结构蛋白NS1、NS2及NS3,3′端的ORF2编码2个结构蛋白VP1和VP2,目前有关PPV的结构和非结构蛋白在其致病过程中的作用及机制尚不清楚,且至今也没有针对PPV结构与非结构蛋白的单克隆抗体,因此,构建PPV全长感染性克隆,用于深入探讨这些蛋白在PPV致病过程中的作用机制势在必行。(方法)本研究首先通过人工合成两端发夹结构,应用融合PCR技术(overlap PCR)体外扩增中间序列,在体外经过无缝克隆技术(Infusion)连接,构建PPV全长感染性克隆质粒,并在全长DNA感染性克隆的VP1上(A3058T)通过无义突变引入Eco R I酶切位点作为遗传标记,用于区分拯救病毒和亲本病毒。采用脂质体将全长感染性克隆质粒转染PK-15细胞进行病毒拯救。(结果)结果显示在盲传至5代可以观察到典型CPE,利用电镜、Western-blot、间接免疫荧光检测,结果表明病毒拯救成功,命名Y-PPV。细胞试验结果显示,Y-PPV感染PK-15细胞后能够引起明显的特征性病变和稳定遗传携带的遗传标记,且具有和亲本毒株相似的复制增殖能力及诱导细胞凋亡特性。动物试验结果发现,Y-PPV与亲本毒株相比具有相似的组织嗜性和致组织病变能力。(结论)该研究结果为进一步探讨PPV的致病机制以及疫苗的研发奠定理论基础和提供试验材料。(本文来源于《中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第二十五次学术交流会、中国病理生理学会动物病理学专业委员会第二十四次学术研讨会、中国实验动物学会实验病理学专业委员会第四次学术研讨会、中国兽医病理学家第四次研讨会论文集》期刊2019-07-27）
苗书魁,魏玉荣,魏婕,米晓云,汪萍[2]（2018）在《口蹄疫病毒O型OHM/02株全长cDNA感染性克隆的构建》一文中研究指出为构建O型口蹄疫病毒(FMDV)的感染性克隆,采用RT-PCR将O型FMDV OHM/02株全长基因组分为5个重迭的片段进行扩增,克隆至载体pUC57中,获得全长cDNA克隆pPO-1。将线性化的pPO-1与含有编码T7 RNA聚合酶的真核表达重组质粒共转染BHK-21细胞,出现致细胞病变效应(CPE)。对拯救的病毒进行RT-PCR扩增、酶切、测序,表明人工设计的分子标记Bam HⅠ酶切位点消失,排除了亲本毒株污染的可能性。间接免疫荧光试验可以检测到绿色荧光,电镜观察可观察到病毒粒子,表明构建了具有感染性的OHM/02毒株全长cDNA克隆。病毒生长曲线表明,拯救病毒与亲本病毒的复制能力和增殖特性相似。OHM/02株全长cDNA感染性克隆的构建及拯救可为FMDV致病机理的研究提供一种重要工具,可促进疫苗的研发。(本文来源于《动物医学进展》期刊2018年01期）
李嘉祺[3]（2017）在《EGFP嵌合柯萨奇A组16型病毒基因组全长cDNA感染性克隆的构建及初步研究》一文中研究指出柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CA16)属小RNA病毒科、肠道病毒属,是引起婴幼儿手足口病(Hand,foot,andmouthdisease,HFMD)的主要病原体之一,在全球范围内曾出现多次大规模爆发流行。CA16感染引起的主要临床症状包括手、足、口部疱疹等,多数病例较轻并具有自限性,但也存在少量个别病例出现无菌性脑膜炎、脑干脑炎、肺水肿和肺出血等重症并导致死亡。疫情的爆发已经成为危害婴幼儿健康的重大社会公共卫生问题,目前临床上仍缺乏防治CA16感染的特效药物和疫苗,因此对于CA16病原学特征的深入研究显得尤为重要。利用反向遗传学技术构建感染性克隆解决了 RNA病毒基因组难以操作的问题,是在cDNA水平上研究RNA病毒的有力工具,能够在体外对病毒基因组进行突变、缺失、嵌合等操作后,由感染性克隆体外转录获得病毒基因组RNA,并转染易感细胞可获得拯救病毒,通过对比这些操作其表型、性状变化的影响,为研究RNA病毒的基因的结构与功能、病毒复制机制和致病机理提供崭新的途径。首先我们构建了 CA16(G20株)基因组全长cDNA感染性克隆。以病毒基因组RNA为模板扩增得到CA16基因组全长cDNA,并将其通过TOPO-TA克隆进入载体。利用T7聚合酶系统以线性化的重组质粒为模板进行体外转录反应得到CA16病毒基因组RNA,并将CA16基因组RNA转染Vero获得拯救病毒,经基因组序列分析、RT-PCR、免疫荧光和透射电镜鉴定,确定拯救病毒为柯萨奇病毒A组16型。CA16拯救病毒的蚀斑形态、体外增殖动力学曲线和乳鼠感染致病特征与其母本CA16野生型病毒基本一致,良好地保留了母本病毒的生物学性状、增殖特性和动物感染与致病特征。在成功构建CA16基因组全长cDNA感染性克隆并获得CA16拯救病毒的研究基础上,我们利用反向遗传学方法将增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)EG基因通过融合PCR插入上述CA16病毒的基因组的5'UTR和VP4基因之间中,并在EGFP基因和VP4基因之间引入2A蛋白酶切割位点,成功构建了 EGFP嵌合CA16基因组全长cDNA感染性克隆。经基因组序列分析、RT-PCR、Western blot、免疫荧光和透射电镜鉴定以及体外Real-time PCR、荧光强度观察、荧光定量分析和动物体内组织冰冻切片荧光观察确定,成功获得了一株表达绿色荧光蛋白报告基因的EGFP嵌合CA16拯救病毒。通过荧光显微镜观察EGFP的表达情况就可以直观指示病毒的生长情况。EGFP嵌合CA16拯救病毒的蚀斑形态、体外增殖动力学曲线和乳鼠感染致病特征与其母本CA16野生型病毒基本一致,但通过对感染乳鼠的生存率、相关组织病毒载量和病理改变的分析后发现,EGFP嵌合CA16拯救病毒的乳鼠致病性较CA16野生型病毒略低。综上所述,本研究利用反向遗传学技术,通过构建CA16感染性克隆和EGFP嵌合CA16感染性克隆并获得拯救病毒,为进一步研究CA16病毒基因功能,寻找病毒毒力位点,检测病毒对细胞的感染情况,定位追踪病毒感染途径和部位,深入研究CA16致病机理和CA16抗病毒药物筛选和疫苗研发奠定基础。(本文来源于《北京协和医学院》期刊2017-05-01）
杨意,舒建洪[4]（2016）在《PEDV全长感染性cDNA克隆的构建》一文中研究指出猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种常见的具有高传播率的猪病,以呕吐、水样腹泻、脱水为主要特征。PEDV属于冠状病毒科,冠状病毒属,具有典型的冠状病毒形态。PEDV能感染不同年龄阶段的猪,其中以新生仔猪的感染率最高。该病的流行给全球养猪业造成了重大经济损失,而且目前常用的PED灭活苗和活疫苗都含有完整的PEDV颗粒,并不安全有效。因此研制新(本文来源于《中国生物化学与分子生物学会2016年全国学术会议论文集》期刊2016-10-20）
高飞,姜一峰,虞凌雪,李丽薇,杨莘[5]（2016）在《猪繁殖与呼吸综合征病毒重组猪瘟C株E2蛋白的全长感染性克隆的构建及分析》一文中研究指出1引言猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)和猪瘟(Classical Swine Fever,CSF)都是临床上严重威胁养猪业的一种严重的接触性传染病。对养猪业造成的经济损失巨大。其致病病原分别为PRRSV和CSFV。CSFV的囊膜糖蛋白E2(gp55)是一种重要的保护性抗原,具有高度的免疫原性,可以诱导机体产生高水平的中(本文来源于《中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第五次学术研讨会论文集》期刊2016-07-20）
袁子文,李平花,孙普,白兴文,袁红[6]（2016）在《一株A型口蹄疫流行毒株全序列的测定及其全长感染性克隆的构建》一文中研究指出【目的】测定一株A型口蹄疫流行毒株的全基因组序列,并构建其全长感染性克隆。【方法】参照已公布的A型口蹄疫病毒序列设计引物,将分离的口蹄疫病毒株A/Sea-97/CHA/2014全基因组分为4个重迭的片段进行RT-PCR扩增,并对其进行序列测定与分析。利用酶切连接法将4个基因片段依次克隆至p Blue Script SKhdv载体中,构建该流行毒株的全长c DNA克隆p QAHN。pQAHN经NotⅠ线性化后转染表达T7 RNA聚合酶的BSR/T7细胞,拯救病毒。【结果】口蹄疫病毒全基因组序列测定结果表明该毒株基因组全长8 171 bp[不包括poly(C)区段和poly(A)尾巴],开放阅读框为6 996 bp,编码2 332个氨基酸,5′和3′非编码区分别为1 091 bp和95 bp。VP1系统发生树分析表明该毒株与A/GDMM/CHA/2013毒株亲缘关系最近,相似性为99.1%。线化全长质粒转染BSR/T7细胞68 h后可观察到典型的细胞病变。拯救病毒的间接免疫荧光、RT-PCR和序列测定结果表明成功拯救出了具有感染性的FMDV。拯救病毒与亲本病毒的噬斑表型及生长曲线试验表明二者具有相似的生长表型和增殖能力。【结论】该研究为我国口蹄疫病原生态分布、分子流行病学调查以及A型FMD新型疫苗的研究提供了有益的材料。(本文来源于《微生物学通报》期刊2016年09期）
梁特,张大丙[7]（2015）在《坦布苏病毒PS株全长感染性克隆的构建与病毒拯救》一文中研究指出1前言坦布苏病毒(Tembusu virus,TMUV)最早分离于马来西亚蚊子中,随后在2002年泰国鸭血清中同样分离到该病毒,但当时均未见其对人和动物存在致病性~([1-2])。然而,自2010年以来,TMUV感染却成为危害我国养鸭业的主要疾病之一~([3])。序列分析显示,我国鸭源TMUV与早期蚊源毒株具有较大的基因序列差异。由此可见,TMUV的基因变异可能是其致病性发生改变的主要原因。本研究旨在以TMUV PS株为材料,构建全长感染性克隆,以便为深入研究该病毒的复制以及致病机制提供技术平台。(本文来源于《第四届全国禽病分子生物技术青年工作者会议论文集》期刊2015-11-06）
高飞,曲泽慧,姜一峰,李丽薇,虞凌雪[8]（2015）在《猪繁殖与呼吸综合征病毒重组猪瘟C株E2蛋白全长感染性克隆的构建及初步应用》一文中研究指出介绍猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)是一种重要的猪传染病病原,像其他套式病毒目成员一样,PRRSV也采用非连续性转录(discontinuous transcription)的方式转录出一系列具有5′和3′共末端的亚基因组mRNA(sg mRNA)用以翻译结构蛋白。在此过程中发挥重要调控作用的顺式作用元件(cis-acting element)是病毒的转录调控序列(Transcription Regulatory Sequence,TRS)。通过位于5′UTR中的Leader TRS和下游基因编码区中的Body TRS的互补配对,发挥其调控作用。目前,基于反向遗传操作技术,PRRSV基因组被用作外源基因表达的载体。单纯融合外源基因构建的重组病毒通常并不具备遗传稳定性,在连续的细胞传代过程中会丢失一部分外源基因的编码序列或者发生碱基突变。但是如果将外源基因置于TRS cassette控制下,使其作为一个新的亚基因组进行转录及之后的表达,以此种方法构建的突变病毒则具有遗传稳定性。另外,插入位点的选择至关重要。在2型PRRSV基因组中,ORF1b/ORF2,ORF4/ORF5这两个位点的相邻基因编码区是有间隔的,没有基因重迭区(overlapping)成为外源基因插入的较好选择。像PRRS一样,猪瘟(Classical swine fever,CSF)也是临床上严重威胁养猪业的一种严重的接触性传染病,造成的经济损失巨大。其病原CSFV的囊膜糖蛋白E2(gp55)是一种重要的保护性抗原,具有高度的免疫原性,可以诱导机体产生高水平的中和抗体。临床上,PRRSV和CSFV两种疫苗均被用于猪场中,但是由于二者免疫的相互干扰,很难获得较好的免疫反应。因此,通过反向遗传操作技术,研发一种新型基因工程重组疫苗能够同时对两种病原的产生免疫反应变得至关重要。基于以上的研究背景,本研究在高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞致弱疫苗株HuN4-F112的全长感染性克隆骨架上,插入CSFV疫苗株C株的E2基因,获得能够稳定表达猪瘟C株E2蛋白的重组PRRS病毒,对其进行一系列病毒特性分析及遗传稳定性检测;并在病毒复制、转录、翻译水平对其与亲本病毒进行比较分析,初步评估其作为疫苗候选株的可行性。材料与方法在HuN4-F112的感染性克隆基础上,通过SOE PCR的方法,在其基因组ORF1b和ORF2之间插入猪瘟C株E2蛋白,并在外源基因3′端下游插入PRRSV的转录调控序列6(TRS6),构建了嵌合突变克隆pA-C-E2,通过MARC-145细胞转染并传代,观察病毒拯救情况以判断突变体的感染性。并用IFA对PRRSVN蛋白和CSFV的E2蛋白的表达水平进行检测。接着通过病毒多步生长曲线的描绘和空斑形态学分析在病毒特性方面对突变病毒和亲本病毒进行比较分析。并对其遗传稳定性进行分析与评估。结果成功构建重组CSFV的E2蛋白的突变全长克隆pA-C-E2,并可以拯救出活病毒vA-C-E2。接着对重组突变病毒vA-C-E2进行遗传稳定性的研究,证明其至少可以在20代的传代过程中保持遗传稳定。免疫荧光(IFA)结果显示,重组病毒不仅能够表达PRRS病毒N蛋白,也可以表达相似水平的猪瘟病毒E2蛋白。接着,对该病毒在病毒学水平进行评估,发现此突变病毒与亲本病毒vHuN4-F112在病毒滴度、空斑形态、蛋白表达等方面差异不显着;多步生长曲线的结果显示重组病毒与亲本毒在病毒peak titer和病毒增殖趋势上相似,无明显差异。结论本研究中构建的重组病毒vA-C-E2为PRRSV研究提供了重要工具,突变病毒并未因为插入外源基因而产生差异,并可以同时表达PRRSV的N蛋白以及CSFV的E2蛋白。初步表明表达猪瘟C株E2蛋白的重组病毒可以作为一种能够同时为PRRSV和CSFV感染提供保护的疫苗候选株,为今后多价疫苗的研发提供了研究基础。(本文来源于《中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会论文集》期刊2015-09-03）
胡兵,杨爽,方志正[9]（2014）在《乙型脑炎减毒活疫苗株全长感染性克隆的构建及表达外源基因的初步研究》一文中研究指出通过构建乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2的全长cDNA克隆,来初步探讨将其作为表达载体的可行性,为下一步利用乙型脑炎病毒作为载体构建嵌合病毒打下基础。利用长片段RT-PCR的方法分两段扩增出乙型脑炎病毒cDNA,通过片段两端的酶切位点,将cDNA依次连接到pACYC184载体。进一步利用分子克隆的手段,在乙型脑炎病毒基因组cDNA的3′非编码区插入增强型绿色荧光蛋白(Ehanced green fluorescent portein,EGFP)基因作为报告基因,通过体外转录和转染,拯救乙型脑炎病毒和表达绿色荧光蛋白的乙型脑炎嵌合病毒。采用RT-PCR、蚀斑实验和荧光显微镜观察等方法对恢复病毒进行鉴定。对恢复病毒进行连续6次细胞传代,从病毒生长特性和结构基因稳定性的角度对恢复病毒传代稳定性进行研究。结果表明成功地扩增并构建得到乙型脑炎病毒的全长cDNA,在此基础上进一步构建得到了乙型脑炎嵌合病毒rJEV-EGFP全长cDNA,经过体外转录和转染获得了活的rJEV病毒及嵌合病毒rJEV-EGFP,并采用了多种方法对其进行了鉴定,拯救出的恢复病毒在已传代的代次内稳定性良好,嵌合病毒rJEV-EGFP可稳定地表达绿色荧光蛋白。本研究应用反向遗传学技术构建并在BHK-21细胞中成功地拯救出了rJEV和rJEV-EGFP活病毒,同时也表明乙型脑炎病毒SA14-14-2株可以作为载体来表达外源基因。(本文来源于《病毒学报》期刊2014年06期）
仝燕许,陈豪泰,潘丽,张永光,王永录[10]（2014）在《口蹄疫病毒Asia 1/JSWX株基因组全长感染性克隆的体外拯救与序列分析》一文中研究指出通过反转录聚合酶链反应,获得了口蹄疫病毒(FMDV)Asia1/JSWX株基因组3′端长片段(长约7.5kb)和5′UTR中ploy(C)前后的2个短片段。5′UTR的2个短片段经融合PCR扩增得到长约710bp的片段。用引物在基因组5′末端引入AflⅡ酶切位点和T7启动子,在5′UTR内引入SpeⅠ酶切鉴定位点,在3′末端引入NotⅠ酶切位点,将融合片段和3′端长片段顺次连接到载体pSL1180。经T7体外转录系统获取的RNA转录本与脂质体共转染BHK21细胞。测序结果表明,构建的病毒基因组全长cDNA为8 197nt,分别包括1个长为1 095nt的5′UTR[含有1个17nt的ploy(C)];1个长6 990nt的ORF;1个长为93nt的3′UTR;之后是18nt的poly(A)尾巴。该全长cDNA克隆与Asia 1/Jiangsu/China/2005株基因组序列的同源性为98.4%。测序和酶切鉴定结果均表明,该口蹄疫病毒株全长cDNA克隆已构建成功,该方法极大地简化了获得FMDV全长cDNA克隆的过程。通过反转录聚合酶链反应、间接免疫荧光试验和蚀斑试验等鉴定,本试验获得了感染性分子克隆;体外拯救获得的基因工程病毒连续传代培养后,可致BHK21细胞产生病变。上述结果表明,构建的cDNA克隆可以作为基因操作的载体,为深入研究安全性好、稳定性高和免疫原性强的基因工程疫苗奠定了基础。(本文来源于《中国兽医科学》期刊2014年08期）
感染性全长克隆论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
为构建O型口蹄疫病毒(FMDV)的感染性克隆,采用RT-PCR将O型FMDV OHM/02株全长基因组分为5个重迭的片段进行扩增,克隆至载体pUC57中,获得全长cDNA克隆pPO-1。将线性化的pPO-1与含有编码T7 RNA聚合酶的真核表达重组质粒共转染BHK-21细胞,出现致细胞病变效应(CPE)。对拯救的病毒进行RT-PCR扩增、酶切、测序,表明人工设计的分子标记Bam HⅠ酶切位点消失,排除了亲本毒株污染的可能性。间接免疫荧光试验可以检测到绿色荧光,电镜观察可观察到病毒粒子,表明构建了具有感染性的OHM/02毒株全长cDNA克隆。病毒生长曲线表明,拯救病毒与亲本病毒的复制能力和增殖特性相似。OHM/02株全长cDNA感染性克隆的构建及拯救可为FMDV致病机理的研究提供一种重要工具,可促进疫苗的研发。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
感染性全长克隆论文参考文献
[1].陈松彪,黄勇,童德文.携带遗传标记的PPV全长感染性克隆构建及其生物学特性研究[C].中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第二十五次学术交流会、中国病理生理学会动物病理学专业委员会第二十四次学术研讨会、中国实验动物学会实验病理学专业委员会第四次学术研讨会、中国兽医病理学家第四次研讨会论文集.2019
[2].苗书魁,魏玉荣,魏婕,米晓云,汪萍.口蹄疫病毒O型OHM/02株全长cDNA感染性克隆的构建[J].动物医学进展.2018
[3].李嘉祺.EGFP嵌合柯萨奇A组16型病毒基因组全长cDNA感染性克隆的构建及初步研究[D].北京协和医学院.2017
[4].杨意,舒建洪.PEDV全长感染性cDNA克隆的构建[C].中国生物化学与分子生物学会2016年全国学术会议论文集.2016
[5].高飞,姜一峰,虞凌雪,李丽薇,杨莘.猪繁殖与呼吸综合征病毒重组猪瘟C株E2蛋白的全长感染性克隆的构建及分析[C].中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第五次学术研讨会论文集.2016
[6].袁子文,李平花,孙普,白兴文,袁红.一株A型口蹄疫流行毒株全序列的测定及其全长感染性克隆的构建[J].微生物学通报.2016
[7].梁特,张大丙.坦布苏病毒PS株全长感染性克隆的构建与病毒拯救[C].第四届全国禽病分子生物技术青年工作者会议论文集.2015
[8].高飞,曲泽慧,姜一峰,李丽薇,虞凌雪.猪繁殖与呼吸综合征病毒重组猪瘟C株E2蛋白全长感染性克隆的构建及初步应用[C].中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会论文集.2015
[9].胡兵,杨爽,方志正.乙型脑炎减毒活疫苗株全长感染性克隆的构建及表达外源基因的初步研究[J].病毒学报.2014
[10].仝燕许,陈豪泰,潘丽,张永光,王永录.口蹄疫病毒Asia1/JSWX株基因组全长感染性克隆的体外拯救与序列分析[J].中国兽医科学.2014