人类神经生长抑制因子的结构、性质与功能

论文摘要

人类神经生长抑制因子（human neuronal growth inhibitory factor，hGIF）属于金属硫蛋白家族，又称金属硫蛋白-3（metallothionein-3，MT3）。它由68个氨基酸组成，包含20个保守的半胱氨酸。和其它金属硫蛋白成员一样，hGlF能结合7份二价d10金属离子诸如Zn2+、Cd2+，形成两个相对独立的结构域，每个结构域分别包裹着一个金属硫簇，结构域之间由一段3个氨基酸组成的linker联接，整个分子呈哑铃形状。hGIF主要在中枢神经系统表达，有研究显示大脑皮层拥有大量富含游离锌的神经元，hGIF的分布同这些神经元的分布基本一致，暗示hGIF可能参与游离Zn2+的细胞内传递与调控。老年痴呆症是一种神经退行性疾病，病人脑提取液中hGIF的表达水平明显低于正常人，这导致神经元不受约束的生长，过度消耗了营养，最终使神经元调亡；此外，对动物模型的研究显示，当大脑受到损伤后hGIF的表达量出现明显变化。这些研究说明hGIF可能与神经元的生长调控和修复有关。尽管关于hGIF抑制神经元生长的机理以及它的靶分子尚且不清楚，种种迹象表明多种因素共同参与调节其生理活性。本实验室已有多年研究金属硫蛋白的历史，曾经在大肠杆菌中构建了金属硫蛋白的高效表达体系，并且优化了纯化步骤，获得很高的蛋白产量；通过基因工程技术，本实验室还曾经构建了一系列hGIF的突变体，并且详细研究了结构与蛋白稳定性、反应性之间的关系。在此基础上，为进一步阐明hGIF结构、性质和功能之间的关系，我们全面而系统的考察了hGIF一系列位点上的突变对神经元生长抑制活性的影响。这些突变体包括：1)针对肽链N端β结构域（1-30）保守的Thr5设计的突变体（AT5、T5A、T5S）；2)针对肽链N端β结构域保守的CPCP序列的突变（P7S／PgA）3)围绕保守的Glu4位点的突变（E4W、△E4、P3S／E4R）；4)NO反应的酸碱催化位点的突变（E23K）；5)围绕肽链C端α结构域（34-68）的EAAEAE插入段设计的突变体（△55-60、E58K、E55／58／60Q、G53／54A）：6)对linker进行改造（△31-34、△32-33、KKS-SP）；7)结构域间的转换杂合（△34-36、βMT3-βMT3、βMT3-αMT1）；8)单结构域（β-domain、α-domain）等。活性测试研究表明，1)β结构域对hGIF的神经元抑制活性是必须的，其中hGIF独有的保守T（5）CPCP（9）序列尤其重要。2)我们还发现，Thr5侧链上的羟基基团同生理活性密切相关，人为地除去羟基将导致突变体生物活性严重丧失。参考突变体蛋白结构和反应性的结果，我们认为一方面Thr5的羟基可能通过形成分子内氢键帮助稳定hGIF的结构，另一方面Thr5也是一个潜在地磷酸化位点。3)再次，虽然保留了TCPCP序列，但是E23K突变体完全失去了神经元生长抑制功能。以往的研究指出，E23K除了金属硫簇的暴露程度提高，其光谱学性质和反应性均和野生型hGIF相似。尽管E23K丧失生理活性的原因有待进一步研究，我们的结果说明除了TCPCP序列，β结构域中的其它残基也可以影响hGIF执行其功能。4)我们还发现，在α结构域中，改变E（55）AAEAE（60）插入段的电荷分布，或者增加它形成α螺旋的倾向，并不太多地影响整个突变体蛋白的生物活性。然而，EAAEAE插入段缺失干扰了蛋白的正常活性。对α结构域的结构解析表明，EAAEAE插入段在hGIF蛋白中是一段非常松散、不受约束的无规卷曲，它使得α结构域的动力学性质更加活泼。进一步，α结构域也通过结构域间的相互作用，影响到β结构域，间接的改变了β结构域的动力学性质和其它相关性质，从而干扰了hGIF蛋白的生理活性。5)最后，在hGIF中linker的部分或完全缺失对活性没有太大的影响，可是，当用SP（甲壳纲动物MT的linker）取代KKS（哺乳动物MT的linker）作为linker时，突变体KKS-SP的生物活性就基本丧失了。从进化的角度看，这也是自然界为什么选用保守的KKS作为linker的一个原因。有研究指出，在酵母双杂交实验中hGIF能与Rab3A蛋白相互作用，并且hGIF和GDP／Rab3A的结合具有特异性（KD=2.6μM）。Rab3A属于Ras家族，能够结合GTP，并具有GTP水解酶活性。当Rab3A与GTP结合时，GTP／Rab3A形成具有活性的蛋白构象，通过和下游蛋白相互作用引发一系列过程，调节神经元突触囊泡的运输；当Rab3A将结合的GTP水解成GDP后，GDP／Rab3A结构的构象发生变化，蛋白失去活性。同时，Rab3A和GDP或GTP的这种结合也受到多种蛋白的调控，包括GEPs（guanine nucleotide exchange proteins）、GAPs（GTPase-activating proteins）和GDIs（GDP dissociation inhibitors）等。目前为止，对Rab3A和hGIF之间关系的了解还非常少。为了探索它们之间的相互作用，我们运用分子克隆构建了GST-Rab3A融合蛋白表达系统质粒，蛋白在大肠杆菌中表达，纯化后蛋白分子量经MS验证正确无误。随后，我们对hGIF和Rab3A的相互作用进行了初步的研究。GIF（即MT3）和金属硫蛋白Ⅰ和Ⅳ（MT1，MT4）都属于金属硫蛋白家族，它们的一级序列具有很高的同源性，可是，只有GIF表现出神经生长抑制活性。GIF的这种生理活性是否同它金属硫簇的结构、性质有关呢?为此，我们考察了hGIF金属硫簇的结构、性质，并同人类MT1g（hMT1g）、小鼠MT4（mMT4）进行了比较。结果表明，hMT1g和mMT4的金属硫簇具有相似的结构和稳定性，而相比之下，hGIF金属硫簇结构有所差异，且稳定性降低；其次，hGIF和hMT1g、mMT4之间金属硫簇结构和稳定性的差异，导致其和巯基试剂的反应性也受到影响；最后，不同蛋白传递金属离子至EDTA的能力依次为hGIF＞hMT1g＞mMT4。总体来看，hGIF在溶液中结构比hMT1g和mMT4更加松散。我们认为，hGIF的这种性质是几个因素共同作用的结果：hGIF相对较多的负电荷，EAAEAE插入段，CPCP保守序列，以及结构域之间的相互作用等，都可能对hGIF的金属硫簇结构和性质产生影响，并进一步影响其功能。总之，通过构建突变体蛋白、神经元培养和活性考察、结构性质研究等一系列手段，我们研究了可能影响hGIF神经元生长抑制活性的各结构基元和特定的氨基酸残基，认为hGIF的生理活性受到多种因素调控，包括Trh5羟基基团、CPCP保守序列、结构域间的相互作用、linker影响、金属硫簇的结构性质等等。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 正文
• 第一章 序论:人类神经生长抑制因子简介
• 第一节 神经生长因子与金属硫蛋白家族
• 1.1.1 金属硫蛋白的定义和分类
• 1.1.2 金属硫蛋白的结构
• 1.1.3 金属硫蛋白的基因调控
• 1.1.4 金属硫蛋白的功能
• 第二节 神经生长抑制因子与老年痴呆症
• 1.2.1 老年痴呆症的分子机制
• 1.2.2 神经生长抑制因子的发现和老年痴呆症
• 1.2.3 神经生长抑制因子的表达和调控
• 1.2.4 神经生长抑制因子的结构
• 1.2.5 神经生长抑制因子的生理功能
• 参考文献
• 第二章 人类神经生长抑制因子及其突变体结构、性质的研究
• 第一节 神经生长抑制因子同金属硫蛋白I、IV的结构、性质比较
• 2.1.1 金属硫蛋白I、IV的表达和纯化
• 2.1.1.1 基因构建
• 2.1.1.2 蛋白表达与纯化
• 2.1.2 神经生长抑制因子和金属硫蛋白I、IV的基本光谱学研究和反应性比较
• 2.1.3 人类神经生长抑制因子的三级结构
• 第二节 人类神经生长抑制因子突变体的构建和性质研究
• 2.2.1 hGIF突变体基因构建和蛋白表达、纯化
• 2.2.2 P7S/P9A突变体的结构、性质研究
• 参考文献
• 第三章 人类神经生长抑制因子（hGIF）及其突变体蛋白与神经元细胞的相互作用
• 第一节 神经元细胞培养实验
• 第二节 β结构域对神经元抑制活性的重要性
• 第三节 α结构域与神经元生长抑制活性
• 第四节 保守linker和结构域改造对蛋白神经元抑制活性的影响
• 参考文献
• 第四章 Rab3A和神经生长抑制因子的相互作用
• 第一节 Rab3A的基因构建、表达和纯化
• 第二节 Rab3A与GIF的相互作用
• 参考文献
• 附录
• 致谢