Survivin基因RNAi真核表达载体对HL-60细胞的抑制作用

论文摘要

目的：白血病是血液系统的恶性肿瘤，细胞增殖与细胞凋亡失衡是其发生的主要原因之一。Survivin是细胞凋亡抑制蛋白家族（lnhibtor of Apoptosis Family of Proteins，IAPs）新成员之一，其表达具有高度特异性，在正常成年组织不表达而在多种肿瘤中高表达，而且survivin的表达与肿瘤的恶性程度及患者的预后密切相关。RNA干扰（RNA interference，RNAi）是双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）分子在mRNA水平封闭相应序列基因的表达使其沉默的过程，是一种序列特异性的转录后基因沉默（PTGS）。RNAi是生物体抵抗病毒入侵、调控基因表达的监控机制。RNAi介导的基因沉默已经成为一种快速有效地研究基因功能和基因治疗的手段。本实验利用转录载体pSINsi-Hu6构建靶向survivin基因的短发夹状RNA（short hairpin RNA，shRNA）的真核表达载体，研究其在白血病细胞株HL-60中对细胞增殖和凋亡的影响，为进一步研究沉寂survivin基因用于白血病细胞的基因治疗提供实验室依据。方法：1．构建针对survivin基因的shRNA真核表达载体，即pSIN／shRNA。2．实验分组：实验分为转染组，阴性对照组，空白对照组；3．采用RT-PCR法检测pSIN／shRNA对HL-60细胞对survivin mRNA表达的影响；免疫组化法检测pSIN／shRNA对HL-60细胞survivin蛋白表达的影响。4．采用四甲基偶氮唑盐光吸收法（MTT法）检测pSIN／shRNA转染HL-60增殖情况。5．应用流式细胞仪Annexin v-FITC／PI法检测细胞凋亡。6．统计学处理所有结果以均数±标准差（（?）±s）表示，应用SPSS 10.0统计软件处理数据，采用单因素方差分析（ANOVA），以α=0.05作为检验水准。结果：1．重组质粒的酶切及测序鉴定：用限制性内切酶BamH I、Cla I双酶切后，琼脂糖凝胶电泳显示：重组载体可产生5606bp和63bp的片断，而空载体产生6522bp的DNA片断。重组质粒经自动基因测序仪测序（上海申能博彩生物公司），结果与设计序列完全相符，所含目的基因序列准确无误，重组质粒构建成功。2．pSIN／shRNA对HL-60细胞survivin mRNA及Survivin蛋白表达的影响：RT-PCR结果显示：4.0μg pSIN／shRNA转染HL-60细胞24、48、72、96h后，转染各时间组与空白对照组和阴性对照组相比，对目的基因mRNA表达水平下调有显著性差异（P＜0.01），阴性对照组与空白对照组间无显著性差异（P＞0.05）。转染各时间组组间比较，转染24h组对目的基因mRNA表达下调水平明显低于48、72、96h组，有显著性差异（P＞0.05）。48h、72h、96h间无显著性差异（P＞0.05）。免疫组化结果显示：4.0μg pSIN／shRNA作用HL-60细胞48h后，空白对照组与阴性对照组Survivin蛋白HL-60细胞中表达阳性积分为（147.32±13.71）和（142.33±14.43），转染组Survivin蛋白表达明显降低，积分为（50.33±7.33）。两对照组间积分均显著高于转染组，与转染组相比有显著性差异（P＜0.01），两对照组间积分无明显差异（P＞0.05）。3．pSIN／shRNA对HL-60细胞的增殖抑制作用MTT法检测结果显示：4.0μg pSIN／shRNA转染细胞后，每24小时检测各组细胞，连续检测72小时，观察pSIN／shRNA对HL-60细胞的增殖抑制作用，24h开始出现抑制作用，48h抑制作用最强，转染各时间组与空白对照组及阴性对照组比较，对HL-60细胞的增殖抑制作用均有统计学意义（P＜0.01），阴性对照组与空白对照组间无差异（P＞0.05）。转染各时间组组间比较，24h组与48、72h组间比较对HL-60细胞的增殖抑制作用差异有统计学意义（P＜0.05），48、72h组间差异无统计学意义（P＞0.05）。本实验表明，pSIN／shRNA对HL-60细胞的增殖抑制作用有时间依赖性和序列特异性，其作用最佳时间为48h。4．pSIN／shRNA诱导HL-60细胞凋亡的作用：转染4.0μg pSIN／shRNA 48h后，pSIN／shRNA组胞凋率可达（20.21±0.75）％，明显高于阴性对照组的（2.58±0.48）％和空白对照组的（1.26±0.30）％，有统计学意义，（P＜0.01）。阴性对照组与空白对照组间差异无统计学意义（P＞0.05）。结论1．成功的构建了针对survivin基因的shRNA真核表达载体，即pSIN／shRNA。2．pSIN／shRNA能明显持续抑制HL-60细胞survivin mRNA及Survivin蛋白的表达。3．pSIN／shRNA能明显持续抑制HL-60细胞的增殖，其抑制作用具有时间依赖性及序列特异性，其作用最佳时间为48h。4．pSIN／shRNA具有诱导HL-60细胞凋亡的作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 论文部分 Survivin基因RNAi真核表达载体对HL-60细胞的抑制作用
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述部分 RNA干扰及其在恶性血液病治疗的研究现状
• 参考文献
• 英文缩略词
• 读硕期间发表文章
• 致谢