抗根结线虫基因的克隆、遗传转化及黑籽南瓜再生体系的建立

论文摘要

根结线虫（Meloidogyne spp.）是专性植物寄生性病原生物,在根部侵染过程中对植物本身的基因进行调控,以诱导植物细胞特化,形成特化的取食结构,危害2000多种植物;病害发生后,一般减产10%-20%,严重的达75%以上;有证据表明,每年导致农作物和植物的损失超过1000亿美元。近年来,随着对线虫侵染方式,植物自身抗病防御体系研究的不断深入,以及分子生物学理论和生物工程技术的不断发展,为利用植物自身防御体系及线虫自身生理生化特点,通过基因工程手段,建立一个具有高效、经济、环保的线虫综合控防策略成为可能。为此,我们开展了抗根结线虫基因工程的研究。本文主要研究结果如下:1克隆了受根结线虫诱导的根结特异性表达的启动子RKNIP,登陆GenBank号为DQ486886,模序分析表明,RKNIP500具有双向启动子的功能,而RKNIP300不具有启动子的功能,但是存在大量的与启动子功能相关的元件,特别是具有25个在根内特异性表达的元件。该启动子诱导抗根结线虫基因在根结内表达,可是作物达到抗根结线虫的目的。2参照NCBI GenBank （accession number AF435976 ） OC-I序列,合成7条引物,并且设计突变位点,然后利用重叠延伸技术,克隆了完整的OC-I-Δ-D86突变基因。参照GenBank （DQ087264）公布的16D10编码序列,设计了2条寡核苷酸序列用于合成16D10基因的双链干扰序列,克隆进了T载体中,命名为pGEM-T-RKNIP300-16D10-33（简写为pTT33）。3为了便于研究抗线虫基因功能表达的差异研究,构建了四个植物表达载体,分别为pRTO、pRO、pRT33、pRTOT33。其中pRTO为TobRB7Δ0.3:OC-I-ΔD86;pRO为CaMV35S:OC-I-ΔD86 ;pRT33为TobRB7Δ0.3: 16D10-33;pRTOT33为CaMV35S: OC-I-ΔD86与TobΔ0.3:16D10-33的双价基因载体系统。为抗根结线虫植物基因工程的遗传转化研究打下了基础。4将OC-IΔD86基因克隆到原核表达载体pet21b中,在1mmol/L的IPTG诱导后5h,OC-IΔD86融合基因在大肠杆菌中得到表达,表达产物处于可溶状态,其表达量占总蛋白的11.4%,可溶性蛋白的16.4%;利用Ni-NTA系统纯化该蛋白并经PEG20000浓缩;活性分析表明该蛋白酶抑制剂在体外表现出对木瓜蛋白酶明显的抑制作用;制备了效价大于10000的鼠抗血清。这为抗根结线虫基因（OC-IΔD86）的转基因植株的验证奠定了基础。5通过农杆菌介导法,将三个载体pRTO、pRT33、pRO,分别转入烟草,其中pRTO、pRO获得了发育正常的再生植株;而转pRT33基因的烟草表型发生变化,表现为叶片由椭圆形变为柳叶形,且叶片丛生,叶色黄花,不能发育成正常植株。对转pRTO基因的烟草植株进行了PCR、SOUTHERN、ELISA检测及表型检测,证明pRTO基因已成功转入烟草中,并表达出了抗性蛋白,转基因植株表现了明显的抗根结线虫的效果。6黑籽南瓜是一种非常优良的瓜类嫁接砧木材料,单是不抗根结线虫。为了使其获得抗根结线虫的特性,首先开展黑子南瓜再生体系的研究。结果表明:以子叶为外植体,基本培养基为MS,合适的芽诱导激素浓度为BA （2.0mg/l）、TDZ （1.0mg/l）、ZT （2.0mg/l）,不定芽再生率分别为91.67%、98.33%、91.67%,KT诱导效果较差;合适的芽伸长培养基为MS+0.25mg/L KT,80%-100%的诱导芽可以发育成正常的芽;合适的生根培养基MS+0.1 mg/l IAA,生根率为100%;驯化移栽后成活率为85%,成功建立了黑籽南瓜不定芽再生体系。利用黑籽南瓜成熟胚为外植体,MS+TDZ0.5mg/L培养基成功建立了黑籽南瓜成熟胚再生体系。以上研究为黑籽南瓜的遗传转化提供了前提条件。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 关于根结线虫的研究
• 1.1 根结线虫的分类、形态特征及形态鉴定
• 1.2 根结线虫的危害
• 1.2.1 现状
• 1.2.2 生活史
• 1.2.3 危害机理
• 2 抗线虫基因工程研究进展
• 2.1 抗线虫效应物
• 2.1.1 蛋白酶抑制剂
• 2.1.2 其他潜在的抗线虫效应物
• 2.1.3 自然抗性基因（R-GENE）
• 2.1.4 RNAi 对基因功能的探索和潜在的抗性
• 2.1.5 抗性基因的叠加
• 2.2 基因工程防治线虫的启动子研究
• 2.2.1 抗线虫效应物和组成型启动子
• 2.2.2 根特异性启动子
• 2.2.3 启动子的改造
• 2.2.4 线虫取食位点的启动子和细胞的减毒作用
• 2.3 生物安全性
• 2.3.1 食品安全性
• 2.3.2 环境安全性
• 3 关于黑籽南瓜的研究进展
• 4 现状分析
• 4.1 Mi 基因抗性
• 4.2 外源抗线虫基因的抗性
• 4.3 诱导型根特异性启动子抗性
• 5 立题依据
• 第二章 基因克隆与载体构建
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 酶及重要试剂
• 1.1.3 菌株和载体
• 1.1.4 培养基
• 1.1.5 试剂配制
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 启动子RKNIP 片断的克隆
• 1.2.2 OCI-ΔD86 的克隆
• 1.2.3 16D10-33 的克隆
• 1.2.4 植物表达载体的构建
• 2 结果与分析
• 2.1 RKNIP 启动子的克隆
• 2.1.1 烟草总DNA 提取结果
• 2.1.2 启动子RKNIP 的克隆
• 2.1.3 RKNIP 阳性质粒的PCR 检测酶切检测
• 2.1.4 测序验证与序列比对
• 2.1.5 RKNIP500 启动子预测
• 2.1.6 RKNIP300 序列分析
• 2.2 OCI-ΔD86 的克隆
• 2.2.1 OCI-ΔD86 的PCR 扩增结果
• 2.2.2 酶切验证
• 2.2.3 测序验证
• 2.3 16D10-33 的克隆
• 2.3.1 pGEM-T-RKNIP- OCIΔ86 中间载体的获得
• 2.3.2 pTT33 的获得
• 2.4 植物表达载体的构建结果
• 2.4.1 pROR 中间载体的验证
• 2.4.2 双元载体pRTO 的验证
• 2.4.3 双元载体pRO 的验证
• 2.4.4 pRT33 的的验证
• 2.4.5 pRTOT33 双价载体的验证
• 3 讨论
• 3.1 基因的克隆与利用
• 3.2 重叠PCR 技术的应用
• 3.3 关于酶切反应
• 3.4 关于连接反应
• 第三章 OC-IΔD86 （ORYZACYSTATIN-IΔD86）基因的原核表达、活性分析及抗体制备
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 质粒、菌株和生化试剂
• 1.1.2 引物设计
• 1.1.3 试验动物
• 1.2 ELISA 检测试剂配制
• 1.3 方法
• 1.3.1 PCR 反应与原核表达载体的构建
• 1.3.2 原核表达与纯化
• 1.3.3 活性分析
• 1.3.4 免疫注射
• 1.3.5 ELISA 检测方法
• 2 结果与分析
• 2.1 pet216-OC-I ΔD86 的鉴定
• 2.2 表达分析
• 2.3 纯化
• 2.4 活性分析
• 2.5 抗原稀释倍数的确定及二次免疫后ELISA 效价
• 2.6 三免后ELISA 效价检测
• 3 讨论
• 3.1 关于抗根结线虫效应物的评价及活性研究
• 3.2 关于PET 载体构建策略
• 第四章 抗根结线虫植物表达载体在烟草上的遗传转化及功能研究
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 农杆菌、质粒和生化试剂
• 1.3 培养基
• 1.4 方法
• 1.4.1 农杆菌感受态细胞的制备
• 1.4.2 质粒转入根癌农杆菌
• 1.4.3 农杆菌培养
• 1.4.4 侵染
• 1.4.5 共培养
• 1.4.6 选择培养
• 1.4.7 生根培养
• 1.4.8 驯化移栽
• 1.4.9 转化植株的分子检测
• 1.4.10 转基因植株的表型与功能分析
• 2 结果与分析
• 2.1 转基因烟草的获得
• 2.2 转基因烟草的分子鉴定
• 2.2.1 CTAB 提取总DNA
• 2.2.2 部分植株的PCR 检测
• 2.2.3 部分植株的Southern 杂交检测
• 2.2.4 部分植株的ELISA 检测
• 2.2.5 转基因烟草表达模式ELISA 检测
• 2.3 抗根结线虫表型鉴定
• 3 讨论
• 3.1 关于转基因沉默
• 3.2 抗线虫机理
• 第五章 黑籽南瓜再生体系的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 植物激素与培养基
• 1.3 方法
• 1.3.1 子叶不定芽再生体系的建立
• 1.3.2 成熟胚外植体不定芽再生体系的建立
• 2 结果与分析
• 2.1 黑籽南瓜子叶不定芽再生体系的建立结果
• 2.1.1 不定芽的再生
• 2.1.2 6-BA 浓度对不定芽发生的影响
• 2.1.3 苗龄对不定芽发生的影响
• 2.1.4 IAA 浓度对不定芽发生的影响
• 2.1.5 细胞分裂素的种类和浓度对不定芽发生的影响
• 2.1.6 芽的伸长
• 2.1.7 不定芽的生根和移栽
• 2.2 黑籽南瓜成熟胚再生体系的建立结果
• 3 讨论
• 3.1 黑籽南瓜再生体系研究优化
• 3.1.1 外植体类型的选择
• 3.1.2 子叶外植体供体苗龄对不定芽发生的影响
• 3.1.3 生长素IAA 对子叶外植体不定芽发生的影响
• 3.1.4 不同的细胞分裂素对子叶外植体不定芽发生的影响
• 3.1.5 成熟胚外植体不定芽再生的探讨
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表的学术论文