登革病毒E蛋白结构域Ⅲ的表达及其在登革热血清学早期诊断中的初步应用

论文摘要

登革病毒（Dengue virus,DV）属于黄病毒科（Flaviviridae）黄病毒属（Flavivirus）,分为四个血清型。可引起登革热、登革出血热和登革休克综合征。登革病毒通过伊蚊传播,主要在热带、亚热带地区流行,在流行区域其发病率和病死率均较高。目前登革的预防主要依赖于切断蚊媒传播,尚无有效的疫苗用于其预防。登革热病毒的早期诊断,对于该病的治疗和控制有相当重要的意义。登革病毒基因组长约11kb,共编码3种结构蛋白和7种非结构蛋白。其中E蛋白是DV最大的结构蛋白和主要包膜糖蛋白,构成病毒颗粒表面的突起。研究表明E蛋白有三个结构域,即结构域Ⅰ、Ⅱ和结构域Ⅲ,第三结构域含有多个抗原表位和宿主细胞受体识别位点,在疫苗,药物及诊断中有良好的应用前景。本研究利用大肠杆菌表达系统分别制备了1-4型DV的E蛋白第三结构域（EⅢ）蛋白,并将1-4型DV的EⅢ蛋白基因串联后融合表达纯化;制备了1-4型抗EⅢ抗原的抗血清,并初步研究了上述重组蛋白在登革热血清学早期诊断中的应用。本研究主要分两个部分:一.重组登革病毒E蛋白结构域Ⅲ的原核表达、功能鉴定及抗血清制备提取病毒RNA并逆转录获得cDNA,PCR扩增1-4型DV的EⅢ基因片段,并通过融合PCR的方法将1-4型DV的EⅢ基因片段连接后获得融合基因rEⅢ,分别将1-4型登革病毒的EⅢ基因编码序列及rEⅢ融合基因克隆至原核表达载体pET30a。在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达1-4型登革病毒的EⅢ重组蛋白及融合的rEⅢ蛋白,SDS-PAGE可溶性分析结果显示表达形式为包涵体。包涵体复性采用稀释复性的方法,复性后蛋白依次经金属螯合层析柱和弱阴离子交换柱纯化,SDS-PAGE结果显示目的蛋白有较高的纯度。Western bolt结果显示表达的重组蛋白均能于登革热感染病人血清发生特异性反应,具有良好的抗原性。1-4型EⅢ重组蛋白抑制DV2型病毒感染BHK-21细胞实验结果显示四型重组E蛋白结构域Ⅲ均能够阻断2型DV感染,但2型EⅢ重组蛋白阻断能力高于其他3型。将1-4型EⅢ重组蛋白免疫新西兰大白兔,所得到的抗血清可以与DV感染的C6/36抗原片反应,1-4型重组蛋白的免疫血清均产生中和2型DV的中和抗体。二.重组登革病毒EⅢ蛋白在血清学早期诊断中的初步应用IgM捕获ELISA（IgM antibody capture ELISA,Mac-ELISA）是世界卫生组织推荐的早期血清学诊断方法,其操作简便且敏感性高。本研究采用改良过碘酸盐氧化法分别将1-4型DV的EⅢ重组蛋白及rEⅢ融合蛋白进行辣根过氧化物酶（HRP）标记,酶标抗原经分子筛纯化后,初步建立了两种IgM捕获ELISA的诊断方法,即以HRP标记的1-4型重组EⅢ蛋白为检测抗原的EⅢ-ELISA法和以rEⅢ融合蛋白为检测抗原的rEⅢ-ELISA法。通过棋盘法确定最佳的酶标抗原稀释度和血清稀释度后,以IFA和panbio试剂盒串联检测的结果为参照,EⅢ-ELISA的灵敏度、特异度、约登指数、阳性预测和阴性预测值分别为86.21%,98.21%,0.8442,96.15%和93.22%,rEⅢ-ELISA法分别为93.10%,100%,0.9310,100%,96.55%。EⅢ-ELISA法与IFA和panbio公司Mac-ELISA试剂盒检测结果的符合率分别为91.95%和88.50%,rEⅢ-ELISA法与IFA和panbio公司Mac-ELISA试剂盒检测结果的符合率分别为95.40%和90.80%。使用自研两种方法检测5份乙脑IgM阳性血清、20份流行出血热病人及70份健康人血清结果均为阴性,说明两种自研方法的特异性均较好。rEⅢ-ELISA法各项统计指标值均优于EⅢ-ELISA法。

论文目录

• 英文缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分:重组登革病毒E蛋白结构域In的表达
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 小结
• 第二部分:重组登革病毒Enl蛋白在登革热血清学早期诊断中的初 步应用
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 小结
• 全文总结
• 参考文献
• 综述
• 致谢