1-磷酸鞘氨醇保护无血清状态下内皮祖细胞的作用及机制的研究

论文摘要

【背景】成人内皮细胞属分化成熟的细胞,增殖能力不强。在组织受损、缺血性疾病和全身炎症反应综合征、多器官功能障碍等病程中,有大量血管内皮细胞受到损害,这些部位修复（再内皮化或血管生成）难以仅仅通过周边的内皮细胞增生、爬行来实现。大量实验发现内皮祖细胞（endothelial progenitor cells, EPCs）在机体内具有修复受损血管内皮和生成新血管的功能。当前,EPCs的分离、培养、鉴定,体内分布、来源、分化、迁徙、归巢、功能及应用等方面正被广泛而深入地研究。本研究第一部分,对从大鼠骨髓中分离、培养、扩增出EPCs及细胞鉴定进行探讨。后天血管生成能力与到达修复局部的EPCs的功能和数量密切相关。在缺血性疾病中,增加缺血部位的EPCs的数量,可获得良好的治疗效果。由于EPCs的修复作用常需要在缺血的环境下完成。因此,如何保护EPC s在不利的内外环境中的生存能力,对改善患者预后具有重大意义,也成为目前研究热点。本研究采用无血清培养法（用去除血清及细胞生长因子的基础培养液培养细胞）干预EPCs,观察在无血清无细胞因子状态对EPCs的影响,并用1-磷酸鞘氨醇（sphingosine 1-phosphate, S1P）干预这种状态下的EPCs,观察S1P对EPCs的抗凋亡作用。Kimura, T等人研究了血浆中的脂蛋白对脐静脉内皮细胞有保护作用的成份,认为S1P通过其受体介导了这种保护作用。同时,外源性S1P也可模拟出这种对内皮细胞的保护作用,提示了S1P对细胞的抗凋亡作用及应用潜能。但是这种物质对EPCs的抗凋亡作用及其机制未见报导。该物质是否能够在血清和生长因子缺乏的不利环境中保护EPCs,减少或阻止EPCs凋亡,保护局部EPCs,达到促进血管内皮修复的作用及机制需要深入研究。【目的】探讨从大鼠骨髓中分离、培养EPCs的方法。观察无血清状态下（用去除血清和细胞因子后的M199基础培养液培养细胞）EPCs的凋亡情况及S1P对这种状态下EPCs的抗凋亡作用,并深入探讨其机制。【研究方法】1、大鼠骨髓来源EPCs的分离、培养和鉴定:采用密度梯度离心法,从大鼠骨髓中分离单个核细胞;采用差速贴壁培养法,在大鼠骨髓中分离出的单个核细胞中,培养、扩增EPCs。主要从细胞形态学、对比应用多种内皮细胞的特征标记及功能检测等方面证实所获细胞为EPCs,完成细胞鉴定,为下一步研究提供基础。2、无血清培养法诱导EPCs的凋亡情况及S1P对EPCs的保护作用:对培养出的EPCs采用无血清培养法进行诱导凋亡,并用不同浓度（0.1、1、10、20μM）S1P进行干预。光镜观察不同时间点细胞形态学改变。Annexin V-FITC凋亡试剂盒检测细胞凋亡率。3、S1P对无血清状态下EPCs保护作用及机制的探讨:采用RT-PCR及Western blot法证实EPCs细胞存在S1P受体。应用受体阻滞剂（PTX）,信号通路阻断剂（U73122、PP2）等,观察S1P对EPCs在无血清状态下抗凋亡能力的改变,用Western blot法检测各种预处理后,S1P对EPCs中Akt磷酸化的影响,探讨这一过程中抗凋亡作用的信号传导机制。同时对比检测培养上清中一氧化氮（NO）的含量及EPCs的凋亡率,探讨S1P对EPCs的作用机制。【结果】1、从大鼠骨髓细胞中可分离培养出EPCs。从大鼠骨髓中分离出的细胞悬液经密度梯度离心后,可分离出骨髓来源的单个核细胞（bone marrow-derived mononuclear cells, BMNCs）;经差速贴壁法培养后,可获得EPCs。细胞呈梭状,可形成集落,符合祖细胞的特性;培养20天左右,可形成典型“铺路石”样内皮细胞。细胞表达CD34、KDR、vWF等分子标记,但仅分离、培养的早期细胞表达CD133,培养9天后,表达CD133标记的细胞仅占总细胞的5%。培养的细胞可吞噬Dil-acLDL,可结合FITC-UEA-1。RT-PCR检测出培养、扩增后的EPCs中表达CD31、vWF及eNOS等内皮细胞特征的mRNA。2、无血清培养法可诱导EPCs凋亡,且凋亡率随时间的增加而升高;S1P对去除血清和细胞因子后的M199基础培养液（以下简称基础培养液）中的EPCs有抗凋亡作用,且抗凋亡作用随S1P浓度的增加而增强。无血清培养法在体外明显导致细胞凋亡,使活细胞数量减少。24小时后,EPCs凋亡率为27.7±1.08%;48小时后凋亡率为为49.3±1.12%。将不同浓度（0.1、1、10、20 M）的S1P加入基础培养液中进行干预,EPCs凋亡率降低。细胞凋亡率随S1P浓度的增加而降低,当S1P浓度为20μM时,几乎可逆转无血清培养24小时诱导的EPCs的凋亡作用。3、S1P通过EPCs膜上G蛋白七次跨膜耦联的S1P受体发挥抗凋亡作用,这种作用与NO升高有关。RT-PCR及western blot的结果表明EPCs主要表达S1P受体1、2、3型;而仅表达少量的S1P受体4、5型。与对照组相比,在加入了不同浓度（0.1、1、10、20μM）S1P的基础培养上清中可测得NO水平增加,同时细胞凋亡率减少,且呈浓度依量性。在上述各组中加入S1P受体阻断剂（G蛋白受体阻滞剂百日咳毒素,PTX）后,S1P的抗凋亡作用均被完全抑制。各组间EPCs的凋亡率与对照组相比差别无统计学意义。培养上清中的NO水平与对照组相比差别也无统计学意义。提示S1P诱导NO生成增加介导了S1P对EPCs的抗凋亡作用。4、S1P对EPCs的抗凋亡作用与活化磷酯酶C（Phospholipase C, PLC）和Src激酶有关。10μM的S1P可显著减少无血清培养诱导的细胞凋亡,加入PLC抑制剂U73122或Scr激酶抑制剂PP2时,可分别观察EPCs凋亡率增加,NO产量减少;与对照组相比,加入抑制剂组凋亡率均降低,差异均有统计学意义。同时加入U73122和PP2时,可消除S1P的抗凋亡作用,与对照组和加入PTX组相比,凋亡率和NO的产生量差异均无统计学意义,其作用与PTX完全阻断S1P受体作用相似。5、U73122对S1P诱导的Akt磷酸化的抑制作用不明显,G蛋白和Src激酶抑制剂可显著抑制Akt磷酸化的表达。用western blot法检测Akt磷酸化可见,加入10μM S1P干预后的EPCs中Akt磷酸化增加,用U73122预处理EPCs后,Akt磷酸化与仅用S1P干预组相比,差异无统计学意义;而用G蛋白抑制剂PTX和Src激酶抑制剂PP2预处理后,可显著抑制磷酸化Akt的表达,与仅用S1P干预组相比,差异有统计学意义;G蛋白抑制剂组与Src激酶抑制剂组,磷酸化Akt的表达差异无统计学意义。提示S1P对EPCs抗凋亡作用是通过S1P受体,再由细胞内两条单独的信号通路介导,生成NO来实现的。【结论】用密度梯度离心法从大鼠骨髓中分离出BMNCs,采用差速贴壁法可培养、扩增出EPCs。S1P能有效地减少EPCs在血清及细胞因子缺乏的环境中的凋亡。这种保护作用与激活EPCs膜上S1P受体,诱导NO生成增加有关;主要通路为S1P/S1P受体/PLC和S1P/S1P受体/Src激酶/Akt这两种途径产生NO有关。S1P对体外缺乏血清和细胞因子环境中的EPCs内皮祖胞有抗凋亡作用,因此,S1P将可被用于促进EPCs在缺血的体内环境中发挥血管生成及修复作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 前言
• 第一部分 大鼠骨髓来源内皮祖细胞的分离、培养和鉴定
• 材料和方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 第二部分 无血清状态下内皮祖细胞的凋亡情况及1-磷酸鞘氨醇对内皮祖细胞的保护作 用
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 第三部分 1-磷酸鞘氨醇对无血清状态下内皮祖细胞的保护作用的机制探讨
• 材料和方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 文献综述
• 参考文献
• 发表论文及其他
• 致谢