原代培养大鼠海马神经元中滋补脾阴方药抗Aβ神经毒性的保护机制

论文摘要

目的:阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种以进行性认知功能障碍为主要特征的神经退行性疾病。现代研究的热点认为β?淀粉样蛋白（amyloid-β-peptide,Αβ）的神经毒性在AD发病机制中起关键作用。Αβ能引起进行性突触功能异常和神经元丢失,最终导致AD中认知功能障碍和行为异常。体内外实验研究Αβ能直接对神经元产生毒性,或增加神经元对兴奋毒的敏感性。突触结构的高度动力学可塑性及突触传递中相应的结构改变是学习记忆的基础,90%的兴奋性突触主要分布于树突棘,树突棘的发育和结构变化受到调节突触活化的分子机制的影响。突触活化可诱导血清诱导激酶（serum-inducible kinase,SNK）靶向树突棘相关的Rap-特异性GTPase-活化蛋白（ spine-associated Rap guanosine triphosphatase activating protein,SPAR）,通过泛素-蛋白酶体通路引起SPAR降解。SPAR作为突触后蛋白通过调节Rap信号和肌动蛋白骨架重塑来发挥调节树突棘形态的作用。Rap活性和肌动蛋白动力学受到突触活化调节而且与突触可塑性有关,了解调节树突棘肌动蛋白骨架的重塑必然有助于揭示奠定学习记忆基础的突触可塑性的分子机制。尚无研究报道在SNK-SPAR途径中Αβ神经毒性是如何发挥作用,进而引起突触可塑性改变。同样,N-甲基-D-门冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate Receptor,NMDAR）参与突触发生、突触传递、突触可塑性、学习记忆等一系列进程。Αβ的神经毒性能引起谷氨酸细胞外堆积,NMDAR功能异常,钙稳态失衡。我们推测是否Αβ神经毒性、SNK-SPAR途径、NMDAR三者之间存在联系。滋补脾阴方药（Zibu Piyin Recipe,ZBPYR）以滋补脾阴为立方原则,针对脾阴虚证而设,含药血清是根据血清药理学方法获得。既往临床和实验研究发现ZBPYR有脑保护作用,含药血清能明显抗谷氨酸兴奋毒,然而关于ZBPYR如何发挥神经保护作用调控突触和树突棘的分子机制我们还不十分清楚。本课题的研究目的在于观察Αβ与SNK-SPAR途径、NMDAR之间的关系,探讨ZBPYR抗Αβ神经毒性保护神经元的作用机制,为AD和其他神经退行性疾病提供了新的研究思路和治疗手段。方法:1.原代大鼠海马神经元培养。2.通过脂质体转染将针对SNK的小干扰RNA（ small interfering RNA,siRNA）导入神经元中,RT-PCR检测SNKmRNA沉寂情况以及SNK沉寂时SPARmRNA表达变化。3.将干粉Αβ1-40配制成溶液,在37℃恒温箱中孵育72h后获得聚集态纤维状Αβ1-40。4.RT-PCR观察神经元暴露于5μMΑβ1-40,在刺激不同时间点SNK、SPARmRNA表达变化。5.以血清药理学方法获得ZBPYR含药血清;不同浓度的ZBPYR含药血清预处理Αβ1-40刺激的神经元,RT-PCR检测神经元中SNK、SPAR、NR1、NR2A、NR2BmRNA表达变化。结果:1.siRNA转染入神经元后,与对照组和RNAi对照组相比,SNKmRNA表达下调,SPARmRNA表达上调,以SNK siRNA1效果最显著。2.在Αβ1-40刺激神经元不同时间点中,与对照组相比,SNKmRNA表达呈上调趋势,SPARmRNA表达呈下调趋势,其中在Αβ1-40刺激2h时SNK、SPARmRNA表达变化达到高峰。3.与对照组相比,Αβ1-40刺激神经元2h后,SNKmRNA表达上调,SPAR、NR1、NR2A、NR2BmRNA表达下调。4.与Αβ1-40组相比,ZBPYR含药血清预处理组SNKmRNA表达下调,SPAR、NR1、NR2A、NR2BmRNA表达上调,以浓度2%ZBPYR含药血清效果最显著。结论:1.siRNA对SNKmRNA表达有抑制作用,相应地SPARmRNA表达上调,表明SNK在SNK-SPAR途径中起关键作用。2.Αβ1-40诱导SNK、SPARmRNA表达变化,且具有时间依赖性,提示Αβ1-40引起神经元损伤的过程与SNK-SPAR途径密切相关。3.ZBPYR含药血清预处理可以明显干预SNK、SPAR、NMDAR亚基mRNA表达变化,提示ZBPYR含药血清预处理对Αβ损伤神经元有保护作用,以2%ZBPYR含药血清效果最显著;同时ZBPYR对Αβ损伤神经元的保护机制与抑制NMDAR过度激活从而干预SNK-SPAR途径有关。

论文目录

• 一、正文
• （一） 中文摘要
• （二） 英文摘要
• （三） 前言
• （四） 材料和方法
• （五） 结果
• （六） 讨论
• （七） 结论
• （八） 参考文献
• 二、文献综述
• （一） 综述
• （二） 参考文献
• 三、致谢
• 四、本课题受如下基金资助