猪FUT1和SLA-DQB基因多态性及抗病育种基础研究

论文摘要

大肠杆菌F18受体（ETEC F18R）相关基因（FUT1）和SLA-DQB基因是与猪抗病育种相关的重要候选基因，本研究分析了猪大肠杆菌F18受体（ETEC F18R）相关基因（FUT1）和SLA-DQB基因多态性及其与生产性能之间的关系，进一步探索了外来猪种与中国地方猪种间FUT1基因和SLA-DQB基因遗传基础的差异，重点探讨了不同基因型猪F18抗性／易感性的相关性，旨在建立猪抗F18大肠杆菌病分子育种的可行性方案，主要结果如下：（1）采用PCR-RFLP和PCR-SSCP技术，分别对14个猪种FUT1基因开放阅读框307bp和857bp位点进行检测，M307位点只有在外来猪种杜洛克、皮特兰中检测到AA型纯合子，外来猪种中的约克夏、长白猪以及所有的国内地方猪种和含有外来猪种血缘成分的猪种均未发现AA型纯合子，国内地方猪种大部分个体为GG型纯合子，其基因型频率为0．789-1．000。所有猪种在M857位点均未检测到AA型纯合子，国内地方猪种中，除临高猪有少量AG型个体（基因型频率为0．290）外，其他猪种均未发现AG型个体。（2）选择M307位点基因型GG的10个个体和AA型的7个个体（该17个个体在M857处既含有AG型，又含GG型）DNA样本进行基因扩增、克隆和测序，结果证实在FUT1基因开放阅读框M307位点确实存在G／A突变，突变的结果导致相应的氨基酸由苏氨酸代替了丙氨酸：在M857位点，本研究首次发现存在C／T突变，突变的结果导致相应的氨基酸由精氨酸变为色氨酸。（3）采用PCR-RFLP技术，对16个猪种SLA-DQB外显子2进行多态性检测，HaeⅢ酶切后共产生11种基因型，共计6种等位基因，其中含有外来猪种血缘成分的猪种、杂交猪种和国内地方猪种中A、B和D均为优势等位基因，具有丰富的多态性；RsaⅠ酶切后共产生10种基因型，共计4种等位基因，其中A和B等位基因在外来猪种、含有外来猪种血缘成分的猪种和国内地方猪种中均为优势等位基因。（4）SLA-DQB基因采用RsaⅠ（酶切位点为GTAC）进行酶切时，在其27bp和111bp处同时发现酶切位点，产生新的基因型DD；采用HaeⅢ（酶切位点为GGCC）进行酶切时，在40bp、167bp和171bp处同时发现酶切位点，产生新的基因型FF。（5）根据各猪种FUT1基因M307等位基因频率，基于Nei氏遗传距离构建NJ和UPGMA系统发生树，应用自举检验估计系统中结点的自引导值。由NJ系统发生树可见，所有的国内地方猪种首先聚为一个大的类群，而含有外来猪种血缘成分的猪种和所有的外来猪种与国内地方猪种遗传距离较远。UPGMA系统发生树也清楚的显示，所有的国内地方猪种首先聚为一个大的类群，而含有外来猪种血缘成分的猪种和所有的外来猪种也聚为一个大的类群，两大类群间遗传距离较远。（6）根据各猪种SLA-DQB基因HaeⅢ酶切结果中各等位基因频率，基于Nei氏遗传距离运用NJ法和UPGMA法构建系统发生树，两种系统发生树的聚类结果基本相同，临高猪、乐平花猪、二花脸、枫泾猪、皮特兰、修水杭猪、苏太猪和藏猪等8个猪种始终聚为一个大的类群，地方猪种、含有外来猪种血缘成分的猪种和外来猪种并没有分为不同类群。（7）苏太猪FUT1基因M307位点各基因型的生产性能比较表明，AG基因型的个体平均生产性能高于GG基因型的个体，AG基因型的个体1胎断奶窝重、2胎断奶窝重、3胎总产仔数和6胎断奶窝重均显著高于GG基因型的个体。（8）苏太猪SLA-DQB不同基因型的生产性能比较表明，HaeⅢ酶切的3种基因型BB、BD和DD分别与RsaⅠ酶切的3种基因型AA、AB、BB相对应，HaeⅢ酶切的3种基因型和RsaⅠ酶切的3种基因型均与2胎断奶成活率显著相关，与3胎总产仔数、产活仔数、初生窝重、断奶仔猪数和断奶窝重显著相关，与6胎总产仔数、断奶仔猪数和断奶窝重也显著相关。其中DD和BB基因型的个体上述生产性能显著高于BB和AA基因型的个体，也高于BD和AB基因型的个体，但差异不显著。（9）仔猪小肠上皮细胞的黏附试验结果显示，30～35日龄M307GG基因型和M307AG基因型断奶仔猪的小肠上皮细胞均能与表达F18ab菌毛标准菌株107／86、诱导表达F18ac菌毛的重组大肠杆菌rE．coli1534及诱导菌体表面展示表达F18黏附亚单位FedF的重组大肠杆菌pnirBMisL-fedF发生黏附作用，而同日龄M307AA基因型断奶仔猪的小肠上皮细胞均不能与上述三株大肠杆菌发生黏附作用。3日龄易感仔猪小肠上皮细胞也不能黏附上述三株大肠杆菌，但可以很好地黏附表达于987P菌毛的大肠杆菌。（10）仔猪小肠上皮细胞的黏附抑制试验中，产F18ab菌毛标准菌株107／86、诱导表达F18ac菌毛的重组大肠杆菌rE．coli1534及诱导菌体表面展示表达F18abFedF亚单位的重组大肠杆菌pnirBMisL-fedF与相应的兔抗F18ab菌毛血清作用后，对30～35日龄M307GG基因型和M307AG基因型断奶仔猪的小肠上皮细胞黏附能力几乎丧失。（11）以本研究的实验方法和结果为指导，结合其他相关资料，以苏太猪为例，提出猪抗F18大肠杆菌病的分子育种规划。

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第一章文献综述

1 猪水肿病流行病学研究概况

1.1 猪水肿病致病机理

1.2 猪水肿病流行病学

2 大肠杆菌F18抗原受体基因的研究概况

2.1 大肠杆菌F18抗原基因结构及功能

2.2 大肠杆菌F18的生物学特性

2.3 大肠杆菌F18受体

3 SLA研究进展

3.1 SLA在染色体上的位置

3.2 SLA的特点

3.3 SLA的分类

3.4 SLA与经济性状的关系

4 猪抗病育种研究进展

4.1 抗病力的遗传基础

4.2 猪疾病抗性遗传机制

4.3 猪抗病育种措施

4.4 开展抗病育种的困难和存在问题

4.5 展望

5 本研究的目的意义及主要研究内容

第二章材料与方法

1 实验材料

1.1 试验动物

1.2 采集组织样品

1.3 细菌来源

1.4 抗体和主要试剂

1.5 主要实验仪器与器械

1.6 主要试剂

1.7 溶液配制

1.8 引物的设计与合成

2 实验方法

2.1 猪耳组织基因组DNA提取

2.2 DNA样品浓度和纯度计算和稀释

2.3 引物溶液的配制

2.4 PCR扩增

2.5 琼脂糖电泳检测

2.6 酶切消化

2.7 10%聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）的制备、电泳和银染

2.8 PCR产物的纯化

2.9 连接反应-pMD19-T Vector连接试剂盒法

2.10 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备—氯化钙法

2.11 转化

2.12 质粒DNA的小规模提取—碱裂解法

2.13 质粒的鉴定

2.14 质粒DNA的序列测定

2.15 仔猪小肠上皮细胞的制备

2.16 细菌的准备

2.17 仔猪小肠上皮细胞的黏附试验

2.18 仔猪小肠上皮细胞的黏附抑制试验

2.19 苏太猪生产性能测定

2.20 统计分析方法

2.21 基因序列的比对及SNPs的鉴别

2.22 品种聚类

第三章结果与分析

1 19个猪种的基因组DNA提取结果

2 猪FUT1基因M307和M857的PCR-RFLP和PCR-SSCP分析及其克隆测序结果

2.1 PCR扩增结果

2.2 M307和M857的PCR-PFLP分型

2.3 SSCP检测结果

2.4 FUT1基因M307和M857位点的序列测定结果和分析

2.5 各猪种FUT1基因的多态性检验结果

2.6 基于各猪种FUT1基因M307等位基因频率的聚类分析

2.7 苏太猪FUT1基因与生产性能的关联分析

3 SLA-DQB基因Rsa Ⅰ和 HaeⅢ的PCR-RFLP分析及其克隆测序结果

3.1 SLA-DQB基因PCR扩增结果

3.2 PCR-RFLP结果

3.3 SLA-DQB基因RsaⅠ和HaeⅢ酶切序列测定结果和分析

3.4 各猪种SLA-DQB基因的多态性检验结果

3.5 基于各猪种HaeⅢ酶切结果中各等位基因频率的聚类分析

3.6 苏太猪SLA-DQB基因与生产性能的关联分析

4 致病性F18大肠杆菌黏附素受体仔猪体外鉴定研究

4.1 仔猪小肠上皮细胞的黏附试验

4.2 仔猪小肠上皮细胞的黏附抑制试验

第四章讨论

1 猪FUT1基因M307和M857的PCR-RFLP和PCR-SSCP分析

1.1 猪FUT1基因M307的多态性

1.2 猪FUT1基因M857的多态性

2 各猪种FUT1基因M307位点和M857位点序列分析

3 SLA-DQB基因RsaⅠ和HaeⅢ的PCR-RFLP分析

4 SLA-DQB基因的序列分析

5 基于各猪种FUT1基因M307和SLA-DQB基因等位基因频率的聚类分析

6 苏太猪FUT1基因M307位点不同基因型个体的生产性能比较

7 苏太猪SLA-DQB基因与生产性能的关系

8 致病性F18大肠杆菌黏附素受体仔猪体外鉴定研究

9 关于未来猪抗病育种研究的设想与计划

9.1 抗病育种研究的设想

9.2 抗病育种研究的计划

结论

参考文献

攻读博士学位期间发表的论文及科研情况

致谢

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