几种镰刀菌的活性检测研究

论文摘要

镰刀菌属是一类形态变异很大的真菌,并且具有重要的经济意义,因此在分类鉴定研究上引起了研究者广泛而深入的研究。传统的形态学方法、免疫学和分子生物学方法已经实现了对镰刀菌检测鉴定,但这些方法都各具局限性,形态学样品前处理繁琐、鉴定周期长、时效性差,免疫学和分子生物学方法存在交叉反应,假阳性和假阴性率较高。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assistedlaser desorption-ionization time of night mass spectrometry,MALDI TOF MS）是新近发展起来的一种分析化学技术,通过获取具有物种特征性的蛋白质指纹图谱,实现物种的检测和鉴定。基于质谱的蛋白质组学技术用于微生物鉴定和检测与传统的方法相比具有操作简单、快速,重复性好,准确度高,自动化和高通量等特点。本文应用MALDI TOF MS方法对来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心及美国、阿根廷的28个种35株镰刀菌进行了分析研究。以Fusarium proliferatum var.minus和Fusarium graminearum作为条件筛选的目的菌,试验了3种单一溶剂处理、2种组合溶剂处理和蜗牛酶处理,以及不同试验因素包括2种基质、3种基质溶剂、5种菌量、4种点样方法、3种点样量、3种水洗培养物次数、5种超声处理时间等,综合分析了影响MALDI TOF MS检测的重要因素,首次获得了MALDI TOF MS检测镰刀菌的最佳试验条件:样品处理用溶剂为70%甲酸:乙腈;最佳基质为HCCA;最佳基质溶剂为乙腈:三氟乙酸:水（20∶1∶19）;最佳菌量约8mg;最佳点样方法为改进的干滴法;最佳样品点样量1μl;最佳水洗次数为水洗一次;最佳超声处理时间为10min。应用该规范化方法,在m/z 2000-19970范围内能够根据各自的特征图谱实现了对镰刀菌属内不同种真菌、大豆猝死综合症病菌的不同菌株真菌的区分。通过同一样品的重复性、批间样品的重复性试验得到Log（score）＞2.000,该方法的重复性较好,为镰刀菌标准质谱数据库的建立奠定了基础。首次初步建立了MALDI TOF MS检测镰刀菌的全新方法:约8mg的菌体水洗一次,依次采用70%甲酸和乙腈处理后,菌体经超声处理10min,1μl样品采用改进的干滴法点样,基质为HCCA,基质溶剂为乙腈:三氟乙酸:水（20∶1∶19）。本文应用来源于美国、阿根廷的我国对外检疫性有害生物大豆猝死综合症病菌北美种Fusariumvirguliforme共8个菌株,经单细胞微量分析系统分别在43℃至47℃5个温度梯度下水浴处理1min至5min 5个时间梯度,荧光染色后,对该病菌活性进行检测,设置传统的萌发试验作为对照,结果表明:该病菌在47℃水浴处理4min即全部失活,SPSS统计分析得出该病菌的活性检测值与处理温度呈极显著负相关,而与处理时间除菌株2-1和22825呈显著负相关外,与其它菌株均呈极显著负相关;所设置的萌发率也与处理温度和处理时间之间呈极显著负相关;活性检测值与萌发率两者之间具有极显著的正相关性。本文首次初步建立了28种植物病原镰刀菌MALDI TOF MS检测方法,首次建立了包含了28个种35株镰刀菌MALDI TOF MS检测的蛋白指纹图谱数据库,为植物病原真菌快速、高通量、自动化检测开辟了新途径,搭建了新检测平台,并首次应用单细胞微量分析系统首次建立了大豆猝死综合症病菌北美种活性检测技术,该方法可以替代传统的孢子萌发方法,从而大幅度缩短该病菌活性检测时间,明显提高了检测效率,对检疫性植物病原真菌活性检测新平台的建立具有重要的参考价值。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 镰刀菌的分类
• 2 镰刀菌鉴定方法
• 2.1 形态学鉴定
• 2.2 酯酶同工酶技术
• 2.3 血清学检测
• 2.4 分子生物学检测
• 2.5 基因芯片技术
• 2.6 红外光谱鉴别
• 3 质谱技术
• 4 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱及应用
• 4.1 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱
• 4.2 MALDI TOF MS原理
• 4.3 MALDI TOF MS应用
• 4.3.1 多肽与蛋白质
• 4.3.2 DNA与RNA
• 4.3.3 高分子化合物
• 4.3.4 小分子化合物
• 4.3.5 微生物检测
• 4.3.5.1 真菌检测
• 4.3.5.2 细菌检测
• 4.3.5.3 病毒检测
• 5 活性检测研究
• 5.1 MTT法及其改良法
• 5.2 SRB法
• 5.3 LDH释放法
• 5.4 同位素掺入法
• 5.5 酸性磷酸酶法
• 5.6 克隆形成实验
• 5.8 活性检测在植物病原菌和酵母上的应用
• 5.9 传统活性检测方法的优缺点
• 6 研究目的及意义
• 第一部分 28种镰刀菌MALDI TOF MS分析
• 材料与方法
• 1 实验材料
• 1.1 供试菌株
• 1.2 实验试剂
• 1.2.1 基质
• 1.2.2 酶
• 1.2.3 其它试剂
• 1.3 仪器
• 1.4 主要试剂的配制
• 1.4.1 基质溶剂
• 1.4.2 基质溶液
• 1.4.3 样品处理用溶剂
• 1.4.4 校正标准样品的制备
• 2 实验方法
• 2.1 供试菌的培养
• 2.2 样品处理
• 2.2.1 溶剂处理
• 2.2.1.1 单一溶剂处理
• 2.2.1.2 组合溶剂处理
• 2.2.2 不同基质及基质溶剂的试验
• 2.2.3 菌量试验
• 2.2.4 点样方法的筛选
• 2.2.5 样品点样量的筛选
• 2.2.6 水洗培养物次数的筛选
• 2.2.7 超声处理时间的筛选
• 2.2.8 蜗牛酶处理
• 2.2.8.1 不同浓度的蜗牛酶处理
• 2.2.8.2 试验蜗牛酶的作用及和溶剂处理确定的较好方法进行比较
• 2.3 MALDI TOF分析
• 2.3.1 仪器参数设置
• 2.3.2 标准品质量数校正
• 2.3.3 图谱分析
• 2.3.3.1 图谱的标峰
• 2.3.3.2 图谱的校正
• 2.3.3.3 图谱的数据库搜索
• 2.3.4 数据库的建立
• 2.4 重复性试验
• 2.4.1 同一样品的重复性试验
• 2.4.2 批间样品的重复性试验
• 2.5 方法的适用性
• 2.5.1 同属内不同种真菌的鉴定
• 2.5.2 同种内不同株真菌的鉴定
• 结果与分析
• 1 样品处理方法的确定
• 1.1 溶剂处理
• 1.1.1 单一溶剂处理
• 1.1.2 组合溶剂处理
• 1.2 不同基质及基质溶剂试验
• 1.3 菌量试验
• 1.4 点样方法筛选
• 1.5 样品点样量筛选
• 1.6 水洗培养物次数筛选
• 1.7 超声处理时间筛选
• 1.8 蜗牛酶处理
• 1.8.1 不同浓度的蜗牛酶处理
• 1.8.2 酶处理上清液分析
• 1.8.3 试验蜗牛酶的作用及和溶剂处理确定的较好方法进行比较
• 1.9 标准试验方法的确定
• 2 重复性试验
• 2.1 同一样品的重复性试验
• 2.2 批间样品的重复性试验
• 3 方法的适用性
• 3.1 同属内不同种真菌的鉴定
• 3.2 同种真菌不同菌株的鉴定
• 4 数据库的建立
• 第二部分 SDS病菌北美种活性检测研究
• 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 供试菌株
• 1.2 试剂
• 1.3 溶液、培养基的配制
• 1.4 常用仪器
• 2 方法
• 2.1 大豆猝死综合症北美种F.virguliforme的培养
• 2.2 孢子的获取及孢子悬浮液的配制
• 2.3 孢子萌发培养时间的筛选
• 2.4 样品孢子致死温度的筛选
• 2.5 染料适用性筛选
• 2.5.1 SYTO、PI处理方法
• 2.5.1.1 单染浓度的筛选
• 2.5.1.1.1 SYTO单染用量的筛选
• 2.5.1.1.2 PI单染用量的筛选
• 2.5.1.2 死、活孢子悬浮液不同比例混合
• 2.5.2 ViaCount处理方法
• 2.5.2.1 染料用量的筛选
• 2.5.2.2 死、活孢子悬浮液不同比例混合
• 2.6 染色时间的筛选
• 2.7 不同温度-时间处理时间处理后的活性检测
• 2.8 单细胞微量分析系统参数的调整及样品检测
• 2.9 萌发试验
• 结果与分析
• 1 孢子萌发培养时间的筛选
• 2 样品孢子致死温度的筛选
• 3 染料的适用性筛选结果
• 3.1 SYTO/PI单染用量的筛选
• 3.2 死、活孢子悬浮液不同比例混合经SYTO/PI染料染色后的活性检测结果
• 3.3 ViaCount染料用量的筛选
• 3.4 死、活孢子悬浮液不同比例混合经ViaCount染料染色后的活性检测结果
• 4 ViaCount染料染色时间的筛选
• 5 单细胞微量分析系统对不同水浴温度处理后的样品活性检测结果
• 6 建立的SDS病菌北美种活性检测方法
• 讨论与结论
• 1.讨论
• 1.1 镰刀菌的MALDI TOF MS检测
• 1.2 影响MALDI TOF MS分析的试验因素分析
• 1.2.1 溶剂处理
• 1.2.2 蜗牛酶处理
• 1.2.3 影响MALDI TOF MS分析其他重要试验因素
• 1.3 SDS病菌的活性检测
• 1.4 活性检测试验因素分析
• 2 结论
• 致谢
• 参考文献
• 论文发表情况
• 攻读硕士学位期间参加的研究项目
• 论文所用缩写及中英文对照
• 附表
• 图版