论文题目: 羊草细胞差异表达基因分析与遗传转化方法研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 植物学
作者: 舒庆艳
导师: 刘公社
关键词: 羊草,离体培养,翻译延伸因子,谷胱甘肽转移酶,基因枪转化
文献来源: 中国科学院研究生院（植物研究所）
发表年度: 2005
论文摘要: 羊草(Leymus chinensis (Trin.) Tzvel),隶属禾本科赖草属,是欧亚大陆草原区东部重要建群种之一。羊草是牧草之王,是我国比较有优势的战略性生物资源,对我国北方畜牧业的发展以及生态环境的保育均具有重要意义。近年来,由于缺乏科学管理、过度放牧等不利影响,加之羊草本身固有的“三低”问题(即抽穗率低、结实率低、发芽率低)已对羊草生物多样性维持构成了严重的威胁,限制了我国人工草地建设和天然草地的改良及沙化治理的步伐。因此,如何通过细胞、分子生物学以及生物技术手段改良羊草、快速评价和创造新的种质; 如何加快育种进程便成为当前亟待解决的问题。本文围绕这些问题开展了系统的研究并取得如下结果: 1.建立了羊草离体培养再生体系,并研究了影响愈伤组织诱导和植株再生的因素,影响植株再生的主要因素为激素配比和基因型。将3～5mm的幼穗接种到含有2,4-D 0～5.0mg/L的N6基本培养基上,随着2,4-D浓度的变化,愈伤组织诱导率不同,最高诱导率为93.21%(基因型C6)、最低为33.35%(吉生1号); 愈伤组织在N6(大)+B5(微)+KT1.0mg/L+BA1.0mg/L的培养基上可以分化出芽,并在1/2MS培养基上生根。羊草基因型W4不同幼穗诱导的愈伤组织在继代培养过程中其生长、褐化死亡等方面存在着差异; 在分化培养过程中,不同幼穗的愈伤组织最高分化率为9.24%,最低分化率为5.26%。2.对来自同一基因型不同幼穗的愈伤组织中差异表达的基因进行了研究。采用DDRT-PCR技术对其差异表达的基因进行了分离,通过银染技术显示差异片段。将得到的差异片段进行回收、克隆测序,得到两个差异片段序列,经过序列分析表明,其中一个片段是与水稻翻译延伸因子eEF-1基因高度同源; 另一差异片段与水稻谷胱甘肽转移酶GST基因高度同源。3.建立了羊草遗传转化方法。在获得羊草离体培养再生体系的基础上,采用基因枪法对羊草两个基因型进行转抗除草剂基因(PAT)的研究。对分别来自基因型W4和C3的愈伤组织各1430和1850块进行转化。在附加1.0mg/L PPT的培养基上进行一系列的筛选培养,共获得了23株再生苗,经过生根筛选培养,得到5株抗性苗,3株来自基因型W4,2株来自基因型C3。对5株植株进行PCR和Southern检测,得到2株阳性苗,均来自基因型W4,对阳性植株经过无性繁殖得到的无性系进行PCR检测及Basta耐受性鉴定,外源基因可以在其无性系稳定遗传并表达,无性系除对Basta具有抗性外,其表型特征与对照无明显区别。
论文目录:
中文摘要
Abstract
缩略词 Abbreviations
第一章 文献综述
1. 禾本科牧草生物技术研究进展
1.1 植物细胞全能性
1.2 禾本科植物的细胞工程
1.3 禾本科植物的基因工程
1.4 羊草及其生物技术研究现状
2. 差异表达基因研究技术
2.1 消减抑制杂交(SSH)
2.2 表达序列标签(EST)
2.3 基因表达系列分析(SAGE)
2.4 微阵列杂交(Microarray Hybridization)
2.5 cDNA-AFLP
2.6 差异显示(DDRT-PCR)
第二章 研究的目的、技术路线、内容和意义
1. 研究的目的
2. 技术路线
3. 研究内容
3.1 羊草离体培养的研究
3.2 研究同一基因型不同幼穗愈伤组织中差异表达的基因
3.3 羊草遗传转化方法的研究
4. 本研究的意义
第三章 羊草离体培养再生体系的建立及影响因素
1. 材料与方法
1.1 实验材料
1.2 方法
2. 结果分析
2.1 再生体系的建立
2.2 愈伤组织的诱导培养
2.3 愈伤组织的继代培养
2.4 愈伤组织分化培养
第四章 羊草愈伤组织细胞内差异表达基因的研究
1. 材料与方法
1.1 实验材料
1.2 方法
2. 结果分析
2.1 RNA 的提取
2.2 愈伤组织的DDRT-PCR 分析
2.3 回收的差异条带的重扩增
2.4 重扩增条带转化获得的单克隆进行PCR 检测
2.5 差异片段分析
第五章 羊草遗传转化方法的研究
1. 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
2. 结果分析
2.1 愈伤组织的准备与基因枪转化
2.2 轰击后的愈伤组织体外过渡培养及筛选培养
2.3 植株的分化再生与选择培养
2.4 再生的小苗生根培养与选择
2.5 转基因植株的分子检测
2.6 经检测阳性的转基因植株无性系分析
结论与展望
一、结论
二、讨论
三、展望
参考文献
攻读博士学位期间发表论文
致谢
发布时间: 2006-04-30
参考文献
- [1].四川小麦转基因技术体系构建及应用研究[D]. 张志清.四川农业大学2004
- [2].棉花体细胞胚胎发生的调控及其抗病虫基因的遗传转化[D]. 吴家和.华中农业大学2004
- [3].虎杖颗粒愈伤组织悬浮培养体系建立与白藜芦醇的生物合成、调控及生物转化研究[D]. 曹庸.湖南农业大学2005
- [4].小麦遗传转化参数优化及其应用研究[D]. 武丽敏.四川农业大学2005
- [5].Genetic Transformation of Wheat for Salt Tolerance[D]. Abdul Razzaq.河北农业大学2005
- [6].籼稻成熟胚再生体系的建立及反义waxy基因转化籼稻的研究[D]. 吴顺.湖南农业大学2005
- [7].高产黄酮苷和萜内酯银杏细胞系选育及黄酮苷积累调控的研究[D]. 刘佳佳.华南理工大学1999
- [8].原生质体融合提高玫瑰茄细胞生长速率的研究[D]. 廖劲松.华南理工大学2004
- [9].剑麻组织和细胞培养诱导蛋白酶的研究[D]. 李斌.华南理工大学1998
- [10].农杆菌介导玉米愈伤遗传转化体系优化及基因工程雄性不育系初步研究[D]. 杨爱国.四川农业大学2006
相关论文
- [1].羊草多糖的分析及其对羊草盐碱耐受性的影响[D]. 孙芳.东北师范大学2010
- [2].利用羊草EST文库克隆耐盐碱相关基因[D]. 于莹.吉林大学2011
- [3].内蒙古中东部草原羊草（Leymus chinensis）种群分化的生态遗传分析[D]. 刘惠芬.南开大学2004
- [4].冰草组织培养再生体系建立及耐旱转基因研究[D]. 霍秀文.内蒙古农业大学2004
- [5].羊草生殖生物学研究[D]. 张卫东.中国科学院研究生院（植物研究所）2004
- [6].青蒿高效遗传转化体系的建立与青蒿素生物合成的分子调控[D]. 韩军丽.中国科学院研究生院（植物研究所）2005
- [7].烟草NtFAD2基因的沉默及功能研究[D]. 杨明峰.中国科学院研究生院（植物研究所）2005
- [8].采用AFLP分子标记和分子生物学方法对资源植物的评价[D]. 徐夙侠.中国科学院研究生院（植物研究所）2006
- [9].羊草乙醛脱氢酶基因的克隆及CBF2转录因子功能的研究[D]. 李新玲.东北林业大学2007
- [10].盐碱胁迫下羊草相关基因及蛋白质的表达谱研究[D]. 解莉楠.东北林业大学2007