免疫调节剂对癫痫发作的影响及相关机制的研究

论文摘要

癫痫是由于神经元突然、间歇性痫样放电导致反复发作的短暂大脑功能失调的一组慢性疾病。神经系统与免疫系统之间存在着广泛的联系,自从Besedovsky提出了免疫-神经-内分泌调节网络学说以来,很多研究提示,癫痫的发病与该网络的调节失衡有关,特别是免疫与癫痫的关系近年有了新的认识。细胞因子不仅是固有免疫反应和适应性免疫反应的主要参与者,也是免疫系统与神经系统共用的信息分子。一些动物实验研究表明,细胞因子IL-1、IL-2、TNF-α等与癫痫发作有关。小胶质细胞和星形胶质细胞是脑内细胞因子的主要来源。星形胶质细胞本身可分泌多种细胞因子如IL-1、TNF-α参与癫痫疾病的发生、发展及转归。而小胶质细胞是关键的前炎症细胞因子（IL-1、TNF-α）和免疫调节性细胞因子（IL-12、IL-18）的主要来源,与癫痫的发生发展也具有密切关系。本室前期的研究发现免疫抑制剂糖皮质激素或环孢霉素对细胞因子诱发的癫痫具有一定的抑制作用,但对于传统致痫剂的致痫作用是否也有调节作用尚少见报道。因此,为了全面探讨免疫调节作用对戊四氮（pentylenetetrazol,PTZ）致痫活动的影响,我们用免疫抑制剂地塞米松（dexamethasone,DEX）和免疫增强剂左旋咪唑（levamisole,LMS）干预戊四氮致痫,并从神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞三个方面研究免疫调节剂干预对戊四氮致痫作用及有关机制的影响。实验共分为两个部分。第一部分免疫调节剂对戊四氮致痫时神经元及小胶质细胞谷氨酸和蛋白激酶C免疫反应的影响谷氨酸（Glu）是中枢神经系统主要的兴奋性氨基酸之一,过量的Glu可以导致神经细胞兴奋性异常增高和细胞毒损害,因而与癫痫的发病关系密切。蛋白激酶C（PKC）是一类Ca2+、磷脂依赖性的蛋白激酶,在中枢神经系统跨膜信号传递过程中起着重要作用,并参与癫痫发病时的信号转导。因此实验第一部分以免疫抑制剂地塞米松和免疫增强剂左旋咪唑干预戊四氮致痫作用,采用免疫细胞化学方法、细胞培养及图像分析技术研究大鼠脑神经元及小胶质细胞内Glu和PKC的表达变化。实验分为在体和离体两个部分。在体实验将大鼠随机分为4组,每组10只:（1）对照组（NS组）:腹腔注射生理盐水;（2）戊四氮组（PTZ组）:腹腔注射戊四氮（60mg/kg/bw）;（3）地塞米松+戊四氮组（DEX+PTZ组）:腹腔注射地塞米松（5mg/kg/bw）后30min再腹腔注射戊四氮（60mg/kg/bw）;（4）左旋咪唑+戊四氮组（LMS+PTZ组）:左旋咪唑（25mg/kg/bw）灌胃连续5d后腹腔注射戊四氮（60mg/kg/bw）。动物行为学变化参照Diehl的标准将癫痫发作程度由轻到重分为0～V级。离体实验:先筛选PTZ作用小胶质细胞反应最明显的时间点,设对照组、PTZ作用2h、6h、12h组。再取PTZ作用最强的时间点,将纯化培养的小胶质细胞分4组,即对照组（不加处理因素）,戊四氮组（PTZ终浓度为0.5 mmol/L）,左旋咪唑+戊四氮组（LMS终浓度为0.5μg/ml+ PTZ终浓度为0.5 mmol/L）,地塞米松+戊四氮组（DEX终浓度为10-4mol/L+ PTZ终浓度为0.5 mmol/ L）。结果:1、动物行为学表现:NS组大鼠未见癫痫发作;PTZ组动物发作为Ⅲ～Ⅳ级;DEX+PTZ组发作为Ⅰ～Ⅱ级;LMS+PTZ组痫性发作达Ⅴ级。2.在体实验免疫细胞化学染色及图像分析结果显示:在大脑皮质各层和海马锥体细胞及齿状回颗粒细胞均有Glu和PKC免疫反应阳性神经元（呈棕黄色）,Glu免疫染色在胞浆着色较深,PKC染色胞膜着色较深,胞浆淡染。Glu和PKC阳性细胞的OD值变化趋势一致:其中PTZ组较NS组表达增强,LMS+PTZ组进一步增强,DEX+PTZ组较PTZ组和LMS+PTZ组明显减弱,差异具有显著性意义（P< 0.05）。3.小胶质细胞免疫细胞化学染色及图像分析结果显示:正常对照组小胶质细胞呈分枝状外观,胞体较小。戊四氮作用2h可见小胶质细胞内Glu和PKC免疫染色增强,细胞形态变化表现为胞体增大突起回缩。6h变化最明显,细胞突起回缩甚至呈圆形,且PTZ组Glu和PKC表达较NS组明显增多,免疫增强剂可进一步增强Glu和PKC的表达,免疫抑制剂则下调其表达。研究结果提示:机体免疫增强或抑制状态可通过调节神经元和小胶质细胞内Glu和PKC的表达进而影响癫痫的发病状态。第二部分免疫调节剂干预对戊四氮致痫时神经元和星形胶质细胞NFκBp65和NMDAR1表达的影响NFκB是一种多极基因调控蛋白,其最常见的二聚体是p50/RelA（p65）异源二聚体,其表达增加及核移位可作为神经元和星形胶质细胞被激活的标志。NMDA受体（NMDAR）是谷氨酸的离子型受体,传递兴奋性突触活动,在癫痫的发病机制中起重要作用。因此本实验第二部分以NFκBp65和NMDAR1作为观察指标,采用行为学观察、免疫细胞化学方法、细胞培养及图像分析技术研究免疫调节剂干预戊四氮致痫时,大鼠脑内神经元及培养的星形胶质细胞内NFκBp65和NMDAR1的表达情况。在体实验:将大鼠随机分为4组,每组8只:（1）对照组（NS组）:腹腔注射生理盐水;（2）戊四氮组（PTZ组）:腹腔注射戊四氮（60mg/kg/bw）;（3）地塞米松+戊四氮组（DEX+PTZ组）:腹腔注射地塞米松（5mg/kg/bw）后30min再腹腔注射戊四氮（60mg/kg/bw）;（4）左旋咪唑+戊四氮组（LMS+PTZ组）:左旋咪唑（25mg/kg/bw）灌胃连续5d后腹腔注射戊四氮（60mg/kg/bw）。动物行为学变化参照Diehl的标准将癫痫发作程度由轻到重分为0～V级。离体实验:按McCarthy的方法进行星形胶质细胞分离纯化培养,先筛选PTZ作用星形胶质细胞反应最明显的时间点,设对照组、PTZ作用2h、6h、12h组。再取PTZ作用最强的时间点,将纯化培养的星形胶质细胞分4组,即对照组（不加处理因素）,戊四氮组（PTZ终浓度为0.5 mmol/L）,左旋咪唑+戊四氮组（LMS终浓度为0.5μg/ml+ PTZ终浓度为0.5 mmol/L）,地塞米松+戊四氮组（DEX终浓度为10-4mol/L+ PTZ终浓度为0.5 mmol/L）。结果:1、动物行为学表现同第一部分。2.在体实验免疫细胞化学染色及图像分析结果显示:在大脑皮质各层和海马锥体细胞及齿状回颗粒细胞层均可观察到NFκBp65和NMDAR1免疫反应阳性神经元。NFκBp65阳性细胞为胞浆或胞核着色呈棕黄色,NMDAR1阳性细胞为胞膜着色。各组大鼠海马CA3区和大脑皮质的NFκBp65和NMDAR1免疫染色的平均光密度测定和统计学分析表明:NFκBp65和NMDAR1阳性细胞的OD值变化趋势一致:其中PTZ组较NS组表达增强,LMS+PTZ组进一步增强,DEX+PTZ组较PTZ组和LMS+PTZ组明显减弱,差异具有显著性意义（P<0.05）。3.星形胶质细胞免疫细胞化学染色及图像分析结果显示:对照组NFκBp65阳性产物位于胞浆中,呈棕黄色颗粒状,PTZ作用2h细胞核内有NFκBp65表达,6h NFκBp65免疫反应明显增强,平均光密度值达高峰,与对照组比较差异具有显著意义（P<0.05）。NMDAR1阳性产物为棕黄色,PTZ作用2h NMDAR1的表达增加,6h表达达高峰,12h表达减弱。DEX+PTZ组NFκBp65和NMDAR1免疫反应较PTZ组弱,但仍见少许星形胶质细胞活化。LMS+PTZ组较PTZ组NFκBp65和NMDAR1的免疫反应明显增强,星形胶质细胞进一步活化,体积明显增大。研究结果提示:免疫增强剂或抑制剂可分别上调或下调NFκBp65的活化和NMDAR1的表达,并通过神经元和星形胶质细胞的共同作用干预癫痫的发生、发展过程。结论本实验从神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞三个方面对免疫调节剂干预戊四氮致痫作用进行了探讨,发现免疫增强剂左旋咪唑或抑制剂地塞米松可分别上调或下调大脑皮质和海马部位神经元内NMDAR1、Glu及PKC的表达和NFκBp65的活化、可影响小胶质细胞Glu及PKC的表达和星形胶质细胞NMDAR1的表达及NFκBp65的活化。研究结果表明:神经系统与免疫系统之间存在着双向调节作用,机体免疫状态的改变可通过影响神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞内的核转录因子、兴奋性神经递质、信使分子等干预癫痫发病状态。本研究为癫痫与免疫-神经-内分泌调节网络的关系提供了新的实验资料,也为临床防治癫痫提供了新的思路。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 免疫调节剂对戊四氮致痫大鼠脑内神经元及小胶质细胞谷氨酸和蛋白激酶C 免疫反应的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 免疫调节剂对戊四氮致痫大鼠脑内神经元和星形胶质细胞NFκBp65 和NMDAR1 表达的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 综述 癫痫与信号通路
• 附录 硕士在读期间发表的论文
• 致谢