白唇竹叶青（Trimeresurus albolabris）蛇毒磷脂酶A2的分离纯化及性质研究

论文摘要

白唇竹叶青（Trimeresurus albolabris）属于蝮亚科（Crotalinae）竹叶青属（Trimeresurus）,为剧毒蛇,是我国特有的毒蛇,主要分布于重庆、云南、四川、贵州、福建、海南、广东、广西和台湾等地区。蝮亚科毒蛇的蛇毒中含有多种可以影响血液系统的酶类,其中磷脂酶A2受到广泛的关注。磷脂酶A2在哺乳动物胰脏和蛇毒毒液中含量较丰富,它能专一催化3-Sn-甘油磷脂2位酰脂键的水解反应,生成溶血磷脂和脂肪酸,还表现出多种药理性质,例如,出血毒性、溶血活性、肌肉毒性、抗凝和诱导水肿等作用。正是由于其特殊的结构和丰富的生物活性,有些蛇毒的磷脂酶A2已经成为蛋白质结构和功能研究的重要模型。国内外先后对五步蛇（Agkistrodom. acutus）、蝮蛇（Agkistrodom. halys Pallas）、竹叶青（Trimeresurus Stejnegeri）、烙铁头（T. mucrosquamatus）等多种蛇毒的磷脂酶A2进行过报道,而对中国产白唇竹叶青蛇毒磷脂酶A2的研究未见报道。本研究以中国产白唇竹叶青蛇毒为研究对象,从中分离纯化一种磷脂酶A2,并对其性质进行研究,主要研究工作包括以下几个方面:1.利用CM-Sephadex C-50阳离子交换层析,Sephadex G-75凝胶层析和Q-Sepharose FF预装柱三步色谱法进行分离纯化,从白唇竹叶青蛇毒中分离纯化出一种分子量约为17.2 KDa的磷脂酶A2。电泳结果显示该酶在还原性和非还原性条件下均为单一条带,表明磷脂酶A2是仅由单一肽链组成的蛋白分子。2.对分离纯化出来的磷脂酶A2的性质进行了分析研究。测得该酶的比活力为4.625×104U/mg,酶的最适作用温度为50℃左右,最适pH值为8.0左右,热稳定性较好;Ca2+、K+、Na+对其酶活性具有增强作用,而Mg2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+则对其酶活性具有明显的抑制作用;EDTA和EGTA对酶活性具有抑制作用,而DTT、PMSF和β-巯基乙醇对酶活性稍有影响,但是影响不大;无蛋白水解活性、精氨酸酯酶活性和类凝血酶活性;有一定的抗胰蛋白酶活性和间接溶血活性;动物实验显示没有水肿活性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩写一览表
• 1 引言
• 1.1 研究目的和意义
• 1.2 本研究的主要内容
• 1.2.1 粗毒的制备
• 2 的分离纯化'>1.2.2 白唇竹叶青蛇毒磷脂酶A₂的分离纯化
• 2 的性质研究'>1.2.3 白唇竹叶青蛇毒磷脂酶A₂的性质研究
• 1.3 本技术的研究路线
• 2 的分离纯化'>2 白唇竹叶青蛇毒磷脂酶A₂的分离纯化
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 主要仪器与设备
• 2.1.2 主要材料与试剂
• 2.1.3 方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 层析结果
• 2.2.2 纯度鉴定及分子量测定
• 2.3 讨论
• 2 的性质研究'>3 白唇竹叶青蛇毒磷脂酶A₂的性质研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 主要仪器与设备
• 3.1.2 主要材料与试剂
• 3.1.3 方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 蛋白质含量测定
• 3.2.2 酶活力测定
• 3.2.3 不同温度对酶活力的影响
• 3.2.4 pH 对酶活力的影响
• 3.2.5 金属离子对酶活力的影响
• 3.2.6 抑制剂对酶活力的影响
• 3.2.7 热稳定性
• 3.2.8 精氨酸酯酶活力的测定
• 3.2.9 蛋白水解酶活性的测定
• 3.2.10 抗胰蛋白酶作用的测定
• 3.2.11 类凝血酶活性测定
• 3.2.12 溶血活性测定
• 3.2.13 水肿活性测定
• 3.3 讨论
• 4 全文小结
• 5 文献综述
• 2 的概述'>5.1 磷脂酶A₂的概述
• 2 的分类'>5.2 磷脂酶A₂的分类
• 2 的理化性质和结构特征'>5.3 磷脂酶A₂的理化性质和结构特征
• 2 的分类'>5.4 蛇毒磷脂酶A₂的分类
• 2 的理化性质'>5.5 蛇毒磷脂酶A₂的理化性质
• 2 的结构特征及催化机理'>5.6 蛇毒磷脂酶A₂的结构特征及催化机理
• 2 的毒理作用及其机制'>5.7 蛇毒磷脂酶A₂的毒理作用及其机制
• 5.7.1 对血液循环系统的作用
• 5.7.2 肌毒性作用
• 5.7.3 诱导水肿形成作用
• 5.7.4 突触前神经毒性作用
• 5.7.5 其他作用
• 2 生物信息学研究'>5.8 蛇毒磷脂酶A₂生物信息学研究
• 2 基因工程的研究'>5.9 蛇毒磷脂酶A₂基因工程的研究
• 2 的研究进展'>5.10 竹叶青属蛇毒中磷脂酶A₂的研究进展
• 2 的研究展望'>5.11 蛇毒磷脂酶A₂的研究展望
• 参考文献
• 附：作者在攻读硕士学位期间发表的论文目录、科研情况
• 致谢