黑麦草biolistics转化体系的建立与抗盐基因片段的克隆

论文摘要

以MS为基本培养基对黑麦草进行胚性愈伤组织的诱导,建立起以多年生黑麦草成熟胚为起始材料的离体再生体系。研究了不同浓度2,4-D对胚性愈伤组织形成的影响,发现2,4-D浓度为5mg/L时诱导胚性愈伤组织效果最佳。利用PDS1000/氦气基因枪将水稻几丁质酶基因导入黑麦草胚性愈伤组织,获得转化植株。将用质粒pARN6（克隆有水稻几丁质酶基因RC24）和质粒pD（克隆有β-葡糖苷酸酶基因gus和除草剂抗性基因bar）共轰击的黑麦草胚性愈伤组织转至附加2mg/L除草剂PPT(商品名Basta?)的培养基上进行筛选和分化,共获得243株再生植株。对筛选得到的再生植株进行PCR和Southern杂交分析,鉴定出18株整合有RC24基因的植株,15株整合有bar基因的植株,以及2株同时转入两个基因的植株。在使用RC24基因的引物进行PCR检测时,从转化体和非转化体都扩增出一条565bp的片段,对该片段进行了序列分析。在同一基因家族多个成员的DNA序列或编码产物的氨基酸序列已知的情况下,可以利用生物信息学软件寻找保守序列,然后根据保守序列设计引物,通过PCR技术扩增出基因组DNA片段和cDNA片段,进一步可以采用末端快速扩增技术（RACE）获得同源性基因的全长序列。本工作从GenBank中搜索获得六种植物的Na+/H+逆向转运蛋白的氨基酸序列和编码基因的DNA序列,利用DNASTAR9.0软件进行比对,找到了多个保守性区域。根据保守性区域的氨基酸序列或碱基序列设计简并引物用于PCR扩增。用200mmol/L NaCl处理黑麦草、高羊茅、早熟禾、翦股颖和荠菜12小时,采取叶片,分别提取总RNA和基因组DNA。利用引物Natha和Nathb进行降温式PCR和梯度PCR,从黑麦草和翦股颖基因组DNA分别扩增出一条DNA片段,克隆、测序后在GenBank中搜索,没有找到与其有同源性的序列;但经过六框翻译得到的氨基酸序列之一与水稻白叶枯病抗性基因Xal具有54%的同源性。

论文目录

第一部分黑麦草离体再生体系的建立和基因枪法介导的遗传转化研究

Ⅰ 文献综述

1 黑麦草遗传转化的研究进展

2 草坪草遗传转化的主要方法

2.1 基因枪转化法

2.2 农杆菌介导法

2.3 原生质体转化法

2.4 硅碳纤维介导法

3 草坪草遗传转化的报告基因和选择标记基因

3.1 报告基因

3.2 选择标记基因

4 转基因草坪草的分子生物学检测

5 外源基因在转基因草坪草中的整合和表达

5.1 外源基因在转基因草坪草中的整合

5.2 外源基因在转基因草坪草中的表达

6 草坪草遗传转化中存在的主要问题和展望

7 本实验的研究目的和意义

Ⅱ 材料与方法

1 黑麦草离体再生体系的建立

1.1 植物材料

1.2 培养基

1.3 多年生黑麦草成熟胚离体再生体系的建立

1.3.1 成熟种子的消毒

1.3.2 胚性愈伤组织的诱导与继代

1.3.3 植株的分化与再生

2 用基因枪法将水稻几丁质酶基因导入黑麦草的研究

2.1 植物材料

2.2 质粒的构建、提取、检测和酶切分析

2.2.1 质粒的构建

2.2.2 质粒DNA的提取

2.2.3 质粒DNA的电泳检测

2.2.4 紫外分光光度法测定质粒 DNA含量

2.2.5 质粒DNA的酶切分析

2.3 金粒的制备

2.4 材料的渗透处理和微弹轰击

2.5 转化体的筛选及植株的再生

2.6 β-葡糖醛酸糖苷酶（gus）基因瞬间表达分析

2.7 再生植株的分子鉴定

2.7.1 黑麦草基因组DNA的提取

2.7.2 再生植株的PCR检测

2.7.3 杂交探针的制备

2.7.4 再生植株Southern杂交检测

Ⅲ 结果与分析

1 黑麦草离体再生体系的建立

2 用基因枪法将水稻几丁质酶导入黑麦草中的研究

2.1 不同微弹用量和轰击次数对GUS表达的影响

2.2 质粒DNA的酶切分析

2.3 转基因黑麦草植株的PCR分析

2.4 基因枪轰击的次数及结果

2.5 PCR检测中非特异片段的分析

2.6 除草剂涂抹实验

2.7 转基因植株的Southern杂交分析

Ⅳ 分析与讨论

1 黑麦草离体再生体系的建立

2 用基因枪法将水稻几丁质酶基因导入黑麦草中的研究

参考文献

第二部分利用简并引物PCR技术克隆抗盐基因片段

Ⅰ 文献综述

1 简并PCR技术研究进展

1.1 简并PCR技术

1.1.1 简并引物

1.1.2 简并引物的设计

1.1.3 简并引物的反应条件

1.2 简并PCR技术在基因克隆中的应用

1.2.1 基因的克隆策略

1.2.2 在基因克隆中的应用

+/H⁺逆向转运蛋白研究进展'>2 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白研究进展

+/H逆向转运蛋白的研究进展'>2.1 植物液泡膜Na⁺/H逆向转运蛋白的研究进展

+在液泡中的区隔化效应'>2.1.1 Na⁺在液泡中的区隔化效应

+/H⁺逆向转运蛋白基因的分离'>2.1.2 植物液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因的分离

+/H⁺逆向转运蛋白基因的功能与作用机制'>2.1.3 植物液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因的功能与作用机制

+/H⁺逆向转运蛋白基因的表达特征'>2.1.4 植物液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因的表达特征

+/H⁺逆向转运蛋白基因表达的信号通路'>2.1.5 调控植物液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因表达的信号通路

+/H⁺逆赂转运蛋白基因在植物耐盐基因工程中的应用'>2.1.6 液泡膜Na⁺/H⁺逆赂转运蛋白基因在植物耐盐基因工程中的应用

2.2 本研究的意义

Ⅱ 实验部分

1 材料和方法

1.1 植物材料

1.2 试剂

1.3 总RNA和 DNA的提取

1.3.1 总RNA的提取

1.3.2 植物基因组DNA的提取

1.4 cDNA第一链的合成

1.5 RT-PCR和PCR反应

1.5.1 引物设计

1.5.2 PCR和RT-PCR反应

1.6 RT-PCR和PCR反应产物的回收

1.7 DNA与载体的连接

1.8 大肠杆菌感受态细胞的制备

1.9 连接产物的大肠杆菌转化

1.10 重组质粒的提取

1.11 重组质粒的酶切鉴定

1.12 DNA序列测定

2 结果与讨论

2.1 总RNA的提取

2.2 利用简并引物进行RT-PCR和PCR反应

+/H⁺逆向转运蛋白的氨基酸序列比对'>2.2.1 几种植物的液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的氨基酸序列比对

2.2.2 PCR反应条件和体系

2.2.3 简并引物PCR反应

2.2.4 产物的回收

2.3 测序结果分析

参考文献

结论

攻读硕士研究生期间发表的文章

图版说明

致谢

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