论文摘要
摘要：从本室分离保存的几丁质酶高产菌株苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringienssis,Bt）Bt50中提取总DNA，再根据已经在GenBank上登录的Bt几丁质酶基因 chi7序列，设计出包含两种不同的限制性内切酶的1对引物ChiF／ChiR，用PCR方法扩增出的几丁质酶全长基因，将PCR产物直接连接到pMD-18T克隆载体上转入E. coliJM109中克隆得到2，025bp包含氨基酸全序列的几丁质酶基因chi7。再根据GenBank上登录的Bacillus subtilis subsp. subtilis str．168（简称BS168）序列（在GenBank上的登录注册号为NC 000964），设计出包含两种不同的限制性内切酶的扩增rpsD启动子的1对引物RpsF/RpsR，用PCR方法扩增出的rpsD启动子基因，将PCR产物直接连接到pMD-18T克隆载体上转入E. coli JM109中克隆得到380bp的rpsD启动子基因，命名为rpsP。然后，将几丁质酶基因chi7和rpsD启动子基因rpsP连接到穿梭载体pAD123上，转化E.coli JM109，筛选得到重组原核表达质粒pAD-rpsP-chi7。 将重组原核表达质粒pAD-rpsP-chi7，电激转化到Bacillus subtilis（abbr.BS）受体菌株BS-2中，用PCR检测重组质粒pAD-rpsP-chi7是否导入，最后筛选得到含有Bt几丁质酶基因的BS-2工程菌。初步研究表明在液体培养基上重组质粒的稳定性遗传优于在斜面固体培养基上的稳定性，同样培养到100世代的条件下，液体培养条件下的质粒丢失率为0.0％，而固体培养条件下质粒丢失率达到了46.73％。而对BS-2和BS-2工程菌进行抑菌实验比较，发现含有几丁质酶的Bs-2比没有外源基因的BS-2对番茄茎基腐病菌和葡萄灰霉病菌这两种病原菌的抑制效果更高，可以达到83.0％以上。