枯草芽胞杆菌lipA基因启动子的修饰及其表达

论文摘要

目前,微生物脂肪酶的应用越来越受到人们的关注,在洗涤剂、手性化合物合成、造纸、生物医药等领域有越来越广泛的应用。枯草芽孢杆菌产生的脂肪酶是已知分子量最小的脂肪酶,它作用的底物范围广,酶学特性优良,有较大的潜在工业应用价值。利用枯草芽孢杆菌和其内源的lipA基因,构建过量表达LipA的枯草芽孢杆菌基因工程菌株,是实现枯草芽孢杆菌脂肪酶大规模工业发酵生产的关键环节。枯草芽孢杆菌DB104是中性金属蛋白酶和碱性丝氨酸蛋白酶缺陷菌株,能够很大程度上减少所表达的胞外蛋白的降解,适于做为过量表达脂肪酶的基因工程受体菌。本文采用对枯草芽孢杆菌DB104 lipA基因启动子进行原位修饰的方法,使其启动子-35区和-10区序列与强启动子的-35区和-10区共同序列相一致,而达到lipA基因高水平表达的目的。本文以枯草芽孢杆菌DB104为出发菌株,采用同源重组的方法,用红霉素抗性基因替换了lipA基因启动子区及部分上游序列,构建了lipA缺陷并带有红霉素抗性的菌株SH-1,作为修饰lipA基因启动子的受体菌。然后采用重叠PCR的方法构建了带有被修饰的lipA启动子的同源重组片段Ln,并连接到质粒pUC18上,构建了重组质粒pUC18-Ln。用pUC18-Ln转化SH-1,在橄榄油基本培养基上筛选出了能够利用橄榄油作为唯一碳源生长的转化子。对转化子在表型和分子水平上的鉴定结果表明,转化子染色体上的lipA基因启动子的-35区和-10区实现了预定修饰,其序列与共同序列一致,所获得的重组菌命名为枯草芽孢杆菌SH-2。SH-2能够在以橄榄油为唯一碳源的基本培养基上生长,没有红霉素抗性。摇瓶发酵显示,SH-2发酵12小时,培养基中的脂肪酶活性达到最高90.80U/L,比出发菌株DB104的酶活21.62U /L提高了4.2倍。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 微生物脂肪酶的应用和生产
• 1.1.1 微生物脂肪酶
• 1.1.2 脂肪酶的应用
• 1.1.3 脂肪酶的生产
• 1.2 微生物脂肪酶的结构和酶学性质
• 1.2.1 脂肪酶的结构特征
• 1.2.2 pH和温度对脂肪酶活性的影响
• 1.2.3 脂肪酶的底物特异性
• 1.2.3.1 位置特异性
• 1.2.3.2 脂肪酸特异性
• 1.2.3.3 立体异构特异性
• 1.2.4 脂肪酶在有机溶剂中的稳定性
• 1.2.5 金属离子对脂肪酶活性的影响
• 1.3 枯草芽胞杆菌的脂肪酶
• 1.3.1 枯草芽胞杆菌
• 1.3.2 枯草芽胞杆菌的纯脂肪酶
• 1.3.3 脂肪酶的编码基因lipA
• 1.3.4 LipA分泌的Sec途径
• 1.4 枯草芽胞杆菌脂肪酶的过量表达
• 1.5 枯草芽孢杆菌基因表达元件的研究进展
• 1.5.1 σ因子
• 1.5.2 启动子
• 1.5.3 核糖体结合位点SD序列
• 1.5.4 终止信号
• 1.6 本文的研究内容和目的
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 主要药品
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 主要仪器
• 2.1.6 PCR和重叠PCR扩增的引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 B. subtilis染色体DNA提取
• 2.2.2 质粒的小规模提取
• 2.2.3 普通PCR扩增
• 2.2.4 重叠PCR扩增
• 2.2.5 酚抽提和乙醇沉淀
• 2.2.6 DNA片段的回收纯化
• 2.2.7 DNA的酶切
• 2.2.8 DNA连接反应
• 2.2.9 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.10 大肠杆菌感受态细胞的转化
• 2.2.11 B.subtilis Spizizen转化
• 2.2.12 琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.13 脂肪酶活力的测定
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 lipA基因表达元件的分析
• 3.1.1 lipA基因启动子分析
• 3.1.2 lipA基因SD序列分析
• 3.1.3 lipA基因终止子的分析
• 3.1.4 LipA信号肽序列分析
• 3.1.5 lipA基因表达元件的修饰方案
• 3.2 构建重组质粒pUC18-L
• 3.2.1 PCR扩增L片段
• 3.2.2 质粒pUC18 的提取及验证
• 3.2.3 pUC18-L的连接、转化及筛选
• 3.3 重组质粒pUC18-Le的构建
• 3.3.1 PCR扩增e片段
• 3.3.2 酶切、连接、转化及转化子验证
• 3.4 脂肪酶缺陷菌株的构建
• 3.4.1 转化和转化子筛选
• 3.4.2 转化子验证
• 3.5 构建重组质粒pUC18-Ln
• 3.5.1 Ln片段的重叠PCR扩增
• 3.5.2 构建重组质粒pUC18-Ln
• 3.5.3 转化子的验证
• 3.6 lipA基因启动子的修饰
• 3.6.1 质粒pUC18-Ln的转化和转化子筛选
• 3.6.2 转化子验证
• 3.7 B. subtilis SH-2 的摇瓶发酵
• 第四章 结论与展望
• 4.1 主要结论
• 4.2 展望
• 参考文献
• 致谢