论文摘要
乳腺炎是现代奶牛业中一种常见的、复杂的炎症性疾病,可造成重大的经济损失。它受遗传、环境等多种因素的影响,在其发生过程中有多种免疫相关基因参与。迄今为止,有关乳腺炎抗性分子机制尚不明了,特别是抗性相关基因的表达调控机制还不清楚。MicroRNA （miRNA）是一类长约22nt的内源性、非编码RNAs,它可负调控基因转录后的表达,在免疫反应过程中有着重要作用；可变剪接（alternative splicing, AS）是在基因转录后水平上对基因的一种调控机制,对基因生物功能的发挥有调控作用。为了探索在乳腺炎发生过程中,miRNA和可变剪接对免疫相关基因BOLA-DQA2的调控机制,以期了解乳腺炎的发病机理,丰富对奶牛乳腺炎抗性的认识。本文初步研究了miRNAs和可变剪接体与乳腺炎的关系。本论文分以下三部分：一奶牛乳腺组织miRNAs表达谱分析在真核细胞中,miRNA对基因表达调控具有重要作用。近年来,已在哺乳动物中发现了许多的miRNAs。为了扩展miRNA数量和分析乳腺组织miRNA表达与乳腺炎的潜在关系,本实验采用Solexa测序方法检测了患乳腺炎奶牛的乳腺组织miRNAs的表达谱,然后利用生物信息学的方法注释miRNAs序列,结果共检测出375个miRNAs序列,其中230个miRNAs为miRNA数据库中已知的,145个为新miRNAs;鉴定出了1个新mirton和1个双向转录miRNA.新发现的miRNAs可能为乳腺炎组织特异性表达的,可能在奶牛乳腺炎发生的过程中起着重要的作用。本研究丰富了牛miRNAs数据库,这些结果将促进哺乳动物基因组的功能注释和miRNAs功能与比较基因组学的研究。二奶牛BOLA-DQA2基因可变剪接体与功能性SNPs的鉴定主要组织相容性复合体二类基因（MHC, major histocompatibility complex）在牛上也叫BOLA-DQA2,它参与免疫应答反应。为了探讨BOLA-DQA2基因变异与奶牛乳腺炎抗性的关系,通过RT-PCR、克隆测序及序列比对的方法,在奶牛乳腺组织鉴定出两种BOLA-DQA2基因剪接体。其中,一种剪接体与NCBI参考序列一致,命名为BOLA-DQA2-complete;新的剪接体命名为BOLA-DQA2-SV1。剪接体BOLA-DQA2-SV1在exon3缺少195bp、在3’-UTR区缺少52bp和167bp。BOLA-DQA2-SV1通过提前引入终止密码子,编码了一个潜在的含有255个氨基酸的蛋白质。序列比对还鉴定出13个新的单核苷酸多态性（SNPs）和多核苷酸多态性（MLNPs）,其中4个SNPs和MLNPs导致蛋白潜在的保守区的氨基酸突变,且一个SNP （c.+1283C>T）发生在bta-miR-2318种子序列区结合的区域,可能会影响bta-miR-2318与靶基因的结合。两种剪接体在健康和患乳腺炎奶牛的乳腺组织中均有表达。在健康和患乳腺炎奶牛的乳腺组织中,BOLA-DQA2-SV1的表达量均显著高于BOLA-DQA2-complete的表达量,表明BOLA-DQA2-SV1是BOLA-DQA2基因的主转录本。BOLA-DQA2-SV1在患乳腺炎奶牛乳腺中的表达量呈2.67倍上调（p<0.05）。上述结果提示,BOLA-DQA2-SV1可能在奶牛乳腺炎抗性方面扮演着重要的角色,而SNPs是否会影响BOLA-DQA2基因的结构以及它们与奶牛乳腺炎的关系还需做进一步研究。三BOLA-DQA2基因不同剪接体靶标niRNAs的表达分析应用靶标miRNA预测软件分析了与BOLA-DQA2基因两种剪接体的3’-UTR结合的miRNAs,并利用茎环-荧光定量PCR （Stem-loop-Q-PCR）分析了5个候选靶miRNAs在健康（n=5）和患乳腺炎奶牛（n=5）乳腺组织中的表达。预测结果显示,靶向BOLA-DQA2-SV1基因的miRNAs数量比BOLA-DQA2-complete少；荧光定量结果表明,在患乳腺炎奶牛的乳腺组织中,5个潜在靶向BOLA-DQA2两个转录本的miRNAs中,除了bta-miRNA-1777a之外,bta-miR-296、bta-miR-2430和bta-miR-671的表达量分别上调1.75、2.59和1.92倍（p<0.05）,而bta-miRNA-2318下调1.43倍（p<0.05）。乳腺miRNAs差异表达的结果与靶基因BOLA-DQA2剪接体的差异表达结果相吻合,提示miRNA可能对BOLA-DQA2基因有重要的调节作用,但还需进一步研究。
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相关论文文献
- [1].渤海黑牛BOLA-DQA2基因SNPs多态性与生长性状的关联性分析[J]. 西南农业学报 2012(01)