论文摘要
Prp8p是迄今已知的最保守的核蛋白之一,生物化学、遗传学等的研究表明,Prp8p可与多种剪切因子发生反应,是U5snRNP的组成部分,在U4/U6-U5三聚体的形成过程中,Prp8p与U6snRNP上的一个与剪切复合体催化核心形成相关的保守区域相接触,为U4/U6-U5三聚体的装配形成所必需,并且通过促进三聚体与5’及3’端剪切位点的相互结合,保持snRNPs之间的相互作用的稳定性而促进剪切复合体催化核心的形成。PRP8分子的JAB功能区能够促进Prp8p的稳定表达,是Prp8p与泛素相互作用的区域,目前,尚无研究揭示泛素在前体mRNA剪切过程中的具体作用,在其他的剪切相关蛋白中也没有发现泛素结合结构域,JAB功能区作为一个新的泛素结合结构域,了解其功能对于研究泛素与前体mRNA的剪切机制有着重要的意义。本实验采用原核表达的方式制备PRP8-JAB融合蛋白,免疫Balb/c鼠后,通过细胞融合制备单克隆抗体并对所制备抗体进行初步鉴定。首先,原核表达选择pGEX-5X-1、pET-32a载体作为表达载体,根据载体的酶切图谱设计引物,将PRP8-JAB domain基因序列分别插入到pGEX-5X-1、pET-32a载体的EcoRI和NotI两个限制性酶切位点之间,PCR反应后,得到目的条带;将扩增的目的片段从胶上回收后,进行T载体的连接;转化、提取质粒后双酶切,再与同时双酶切的表达载体pGEX-5X-1、pET-32a载体进行连接,然后再转化,各挑取两个阳性克隆,摇菌后,进行测序鉴定。将测序鉴定正确的PRP8-JAB表达载体转化入BL21菌株后诱导表达,获得正确表达的目的蛋白PRP8-JAB并纯化;其次,将纯化的GST-PRP8-JAB融合蛋白与等体积福氏完全佐剂进行充分乳化,对Balb/c小鼠进行多点皮下注射。首次免疫后4周加强免疫一次,免疫原用量减为首免得一半,并与福氏不完全佐剂充分乳化。两周后ELISA法检测效价,效价在1:8000以上的小鼠即可进行加强免疫,加强免疫三天后进行细胞融合,ELISA法筛选能够稳定分泌抗PRP8-JAB mAb的阳性克隆,并亚克隆,共获得17株能够稳定分泌PRP8-JAB单克隆抗体的细胞系;第三,用HIS-PRP8-JAB融合蛋白通过Western blot对所获单克隆抗体的进行鉴定,同时,根据已有的文献报道[21],用RIPA裂解液裂解Hela细胞,以Hela细胞总蛋白为电泳样品,Western blot鉴定单克隆抗体的特异性。LDE021、LGB057、LED096、LEB0311、LAB013、LGB071、LAD0224、LIA083、LIF022、LBD1010、LHB0614、LHB0510、LHB0924、LCE041、LGB031、LGC093均可以识别HIS-PRP8-JAB融合蛋白,其中有11株抗体LAD0224、LCE041、LCF041、LDE021、LEB0311、LED096、LGB071、LGC093、LHB0510、LHB0614、LIF022可以特异的识别Hela细胞中分子量约为220kDa的蛋白。上述鼠抗人单克隆抗体的广泛应用,将为今后PRP8分子的功能研究奠定基础。抗体除了可应用于蛋白结构、定位、功能等常规的生命科学研究外,在临床诊断和治疗方面也具有重要的意义。