猪肺炎支原体P46蛋白与DnaK蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

论文摘要

猪支原体肺炎（Mycoplasma Pneumoniae of Swine,MPS）是由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）引起的一种慢性呼吸道疾病,其主要临床症状为咳嗽和气喘,病变特征是在肺尖叶、心叶、中间叶和膈叶前缘呈肉样或虾肉样实变,该病发病率高而死亡率低。本研究利用Mhp 168株F350代全菌蛋白免疫小鼠,以期获得能稳定分泌针对Mhp细胞膜蛋白P46蛋白、热休克蛋白DnaK蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株。1.抗Mhp膜蛋白P46蛋白单克隆抗体本研究利用本实验室保存的Mhp P46蛋白重组阳性质粒大量表达并纯化的P.46蛋白作为检测原,Mhp168株F350代全茵蛋白作为免疫原,按400μg/只的剂量与等量弗氏完全佐剂进行乳化,经皮下多点注射免疫4-6周龄BALB/c小鼠。每隔2周用弗氏不完全佐剂乳化的168全菌蛋白免疫1次,并在融合前3d用168全菌蛋白加强免疫1次。取脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞进行融合,利用P46蛋白、Mhp168全菌蛋白、空载体蛋白筛选能分泌P46蛋白抗体的杂交瘤细胞株,经过3次亚克隆,获得了1株能稳定分泌抗P46蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为2F3.Western Blot分析显示,2F3能与Mhp168株F350代全菌蛋白及大肠杆菌表达的P46重组蛋白产生反应,与空载体蛋白、猪鼻支原体（mycoplasma hyorhinitis）蛋白不产生反应。2F3与Mhp 168株F105代强毒株、J株、Mhp临床分离株XLW-1、XLW-2、XLW-4、AH、XLW-4、WX有特异性反应。亚型鉴定显示,该抗体的重链为IgG2b型,轻链为K链。采用间接ELISA测得2F3细胞上清与P46蛋白的反应效价为1：1600,与168全菌蛋白的反应效价为1：160；腹水与P46蛋白的反应效价为1：204800,与168全菌蛋白的反应效价为1：51200,腹水经辛酸-硫酸铵沉淀法纯化后及冻干后抗体效价均为1：51200。2.抗Mhp热休克蛋白DnaK蛋白单克隆抗体本研究利用本实验室保存的猪肺炎支原体DnaK蛋白重组阳性质粒大量表达及纯化DnaK蛋白。利用超声破碎获得的168株F350代全菌蛋白作为免疫原免疫小鼠,免疫剂量为400gg/-。应用淋巴细胞杂交瘤技术,取脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞进行融合,用DnaK蛋白、168全菌蛋白、空载体蛋白三者筛选能分泌DnaK蛋白抗体的杂交瘤细胞株,经过3次亚克隆,获得了3株能稳定分泌DnaK蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为3E2、5D10、3A8。Western Blot分析显示,3E2、3A8及5D10能与Mhp全菌蛋白及大肠杆菌表达的DnaK重组蛋白产生反应,与空载体蛋白不反应,3E2及5D10与猪鼻支原体无反应,而3A8与猪鼻支原体产生反应。3E2、5D10与Mhp168株F105代强毒株、J株、Mhp临盏床分离株XLW-1、XLW-2、XLW-4、AH、XLW-4、WX有特异性反应。亚型鉴定结果显示,3株杂交瘤细胞的重链均为IgG1型,轻链菌为K链。采用间接ELISA测得3E2、5D10、3A8细胞上清与DnaK蛋白的反应效价为1：51200-1：102400,与168全菌蛋白的反应效价均为1：640-1：1280；3株单抗腹水与DnaK蛋白及168全菌蛋白反应的效价均为1：106,腹水经辛酸-硫酸铵沉淀法纯化后效价仍为1：106。综上所述,本研究共获得了1株分泌Mhp P46蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,3株分泌Mhp DnaK蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,从而为进一步Mhp致病机理的研究,Mhp P46蛋白及DnaK蛋白抗原表位的确定,以及Mhp血清学诊断方法的建立奠定基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语及符号
• 第一章 猪肺炎支原体蛋白功能与单克隆抗体的研究进展
• 1 猪肺炎支原体生物学特征
• 1.1 形态特征
• 1.2 培养特性
• 2 猪肺炎支原体主要蛋白
• 2.1 黏附因子
• 2.2 细胞膜蛋白
• 2.3 细胞质蛋白
• 2.4 热休克蛋白
• 3 猪肺炎支原体蛋白单克隆抗体研究进展
• 3.1 抗Mhp P97蛋白单抗
• 3.2 抗Mhp P46蛋白单抗
• 3.3 抗Mhp P74蛋白单抗
• 3.4 抗Mhp P36蛋白单抗
• 3.5 抗Mhp DnaK蛋白单抗
• 3.6 抗Mhp P65蛋白单抗
• 参考文献
• 第二章 猪肺炎支原体细胞质蛋白P46蛋白单克隆抗体的制备与鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 P46蛋白的纯化
• 2.2 P46蛋白Western Blot的鉴定
• 2.3 间接ELISA法检测免疫后小鼠效价
• 2.4 杂交瘤细胞株的建立
• 2.5 P46单克隆抗体的鉴定
• 2.6 P46单克隆抗体的纯化
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三章 猪肺炎支原体热休克蛋DNAK蛋白单克隆抗体的制备与鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 DnaK蛋白的纯化及鉴定
• 2.2 间接ELISA法测免疫后小鼠效价
• 2.3 DnaK单抗杂交瘤细胞株的建立
• 2.4 DnaK单克隆抗体的鉴定
• 2.5 DnaK单克隆抗体的纯化
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 致谢
• 附录