论文摘要
苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）是世界上应用范围最广的杀虫微生物,其杀虫活性主要来源于芽胞形成过程中产生的杀虫蛋白,对研究杀虫蛋白结构和功能方面的研究是当前的一个比较热门的话题。苏云金芽胞杆菌表达的Cry1Ac蛋白是就目前来说是对鳞翅目昆虫的毒性最高,并且研究最多的Bt蛋白之一,不仅在农业生产、森林管理上,在蚊虫控制及水环境生态系统中也具有较为广泛的应用,但是Cry1Ac蛋白结构与功能的相关性并未完全明确,所以需要运用基因突变技术来进行较为深入的阐释。本论文使用易错PCR方法对苏云金芽胞杆菌crylAc基因进行突变,从突变菌株中筛选并得到了对棉铃虫杀虫毒力提高的突变株,通过对突变前后Cry1Ac蛋白理化性质的改变从而得到了蛋白结构与功能的生物信息学证据。我们选择了不同Mg2+和Mn2+浓度进行易错PCR实验,通过对突变基因的测序得到最适的PCR条件以扩增cry1Ac基因。之后,将其连接至带有Bt启动子和终止子的pHT315质粒上构建成重组质粒pHT315ptAc。将该质粒热击转化至大肠杆菌Top10感受态后我们使用了快速裂解的方法鉴定转化子。然后,我们挑取多个阳性转化子接种至同一培养基中,提取其质粒电转至Cry-B感受态细胞中。在对突变菌株进行初筛、复筛等进行各项鉴定后,得到了一些突变株。对该突变株进行生物活性测定,并对统计结果进行分析后得到了突变株2-23,该突变株对棉铃虫的杀虫毒力较野生株有了明显地提高。在对突变株2-23 Cry1Ac蛋白进行镜检和SDS-PAGE分析后,发现其与野生株相比在显微形态学和SDS-PAGE检测结果上区别并不大。但对其生测的结果表明突变株2-23产生的蛋白对棉铃虫的毒力较野生株有明显的提高。在提取突变株2-23的pHT315ptAc质粒并对其进行DNA测序后发现突变株2-23 cry1Ac基因的第497位发生了基因突变,使Cry1Ac蛋白第166位的氨基酸由天冬酰胺突变为丝氨酸。经过分析得知该位点的突变提高了α5螺旋整体的疏水性,使α5螺旋在与受体结合时更有利于与疏水脂质界面相结合,这就提高了离子通道形成的效率和能力。通过三维结构的分析还发现突变后的丝氨酸与α7螺旋第250位酪氨酸相连的氢键生了断裂。氢键的断裂可能造成α5和α7螺旋的粘滞度下降,使Cry1Ac蛋白在与受体结合时,α5和α7螺旋更容易产生构象的变化,导致α4-loop-α5发夹结构更易形成。以上几点可能是导致突变株2-23产生的Cry1Ac蛋白毒力提高的原因。