纳米铜肝肾毒性及其机制研究

论文摘要

纳米铜在工业领域和生物医学领域有良好的应用前景,但毒理学资料甚少。本课题结合体内、外试验方法从细胞和整体水平探讨纳米铜的生物学效应（毒性）。目的在于揭示纳米铜的潜在靶器官、毒效应特征、识别毒性相关生物标志物,探讨毒性机制,为纳米铜的安全性评价、毒性监测及干预提供理论依据。研究结果如下:纳米铜和微米铜粒子的原始尺寸及分布分别为25nm （560nm）和17μm （0.538μm）,纯度不低于99.9%。与微米铜相比,纳米铜在溶液中具有较高的离子化倾向。其中与人工胃液作用2 h,纳米铜和微米铜的溶解率分别为2.1%和0.67%;采用完全培养基和1% HPMC新鲜分散的纳米铜悬浮液中纳米铜的离子转化率分别为27.01%和0.014%;40,100μg/ml纳米铜培养基悬浮液在培养环境下孵育24 h,纳米铜粒子可全部转化为铜离子;HepG2细胞不直接摄取纳米铜粒子。纳米铜诱导的细胞形态学变化特征分别为:HepG2细胞内出现大小不等的空泡,线粒体、内质网及细胞核损害明显,严重者表现为多数细胞器消失;HK-2逐渐变圆,黏附性变差、脱落死亡;两种细胞的形态学变化均具有明显的剂量和时间依赖性。纳米铜可以剂量依赖性方式诱导两种细胞活力下降,作用24h对HepG2和HK-2细胞的IC50值分别为35.2和41.3μg/ml;相同摩尔浓度的纳米铜与氯化铜对HepG2或HK-2细胞活力抑制无差异;一价铜离子特异性螯合剂BCS可抑制纳米铜或氯化铜诱导的细胞毒性。纳米铜可以剂量依赖性的方式诱导HepG2细胞凋亡,并且在此过程伴随线粒体膜电位降低和细胞内活性氧升高,后者可进一步诱导细胞的脂质过氧化损害;纳米铜与细胞作用可引起负责细胞铜离子摄取、细胞内游离铜的螯合及铜的伴侣分子Ctr1、MT1X、MT2A、Atox和Cox17的mRNA表达水平出现不同程度上调,细胞内金属硫蛋白表达增强。大鼠纳米铜急性或亚急性经口毒性表现相一致,主要包括腹泻、食欲减退、体重明显下降、严重者伴有步态不稳,震颤及角弓反张;大鼠纳米铜急性经口毒性的LD50值及95%置信区间分别为834.3（790930）mg/kg,微米铜的LD50值>2000 mg/kg;肝脏和肾脏是纳米铜的主要作用靶器官。纳米铜经口反复染毒5d可致大鼠肝、肾结构和功能损害,其中以200 mg/kg/d最为明显,可导致大鼠血清ALT、AST、TP、TG、TBILI、TBA、BUN和CREA水平明显升高,ALP和TCHO水平明显降低;肝细胞呈点状或小灶性坏死;肾皮质和皮髓交界部位小管损害明显,肾小管上皮细胞广泛变性坏死,管腔内可见橘红色结晶异物沉积;脾脏被膜萎缩,白髓减少。染毒结束一周,肝肾损害未完全恢复正常。50,100 mg/kg/d组,大鼠血清TCHOL和TG明显升高,肾近曲小管上皮细胞轻度肿胀,损害程度明显较高剂量组轻。微米铜200 mg/kg/d组,大鼠血清生化指标未见明显异常,部分大鼠肾近曲小管上皮细胞呈轻度肿胀。大鼠的血清、尿液、肝脏和肾脏组织萃取成分的代谢组学分析表明:纳米铜200 mg/kg/d可诱导大鼠血清醋酸盐,氮氧三甲胺,肌酐,饱和脂肪酸（CH2）n,CH2CH2*CO,CH2CO和不饱和脂肪酸C=CCH2C=C,CH=CH,磷脂CH2OPO2-,CH2OCOR水平升高,血糖降低;肝组织中肌酐升高,谷氨酰胺和牛磺酸降低;肾组织中乳酸升高,牛磺酸和糖降低;肝肾组织中甘油三酯类CH3–（CH2）n、（CH2）n和C=CCH2C=C均升高。纳米铜200 mg/kg/d染毒早期,可诱导大鼠尿液中柠檬酸和α-酮戊二酸降低;染毒5d,可导致大鼠尿液中柠檬酸、α-酮戊二酸、乳酸、醋酸盐、N-氧三甲胺、糖和氨基酸水平升高和肌酐明显降低,提示出现典型的急性肾小管坏死和肾小球滤过功能降低。纳米铜200 mg/kg/d染毒大鼠尿液的时效轨迹分析表明,D56损伤最为严重,恢复期醋酸盐、N-氧三甲胺、柠檬酸和肌酐可作为监测指标。此外,纳米铜可以剂量依赖性方式诱导大鼠血清及肝肾组织中甘油三酯类成分升高。综上可知,纳米铜为中等毒材料,肝脏和肾脏是纳米铜的主要作用靶器官;大鼠纳米铜短期反复经口染毒5d,50 mg/kg/d接近最低观察到有害效应水平;相同质量浓度下,纳米铜的毒性明显高于微米铜,小尺寸、大比表面积和高表面活性是纳米铜发挥生物学效应的重要基础,转化为铜离子是纳米铜诱导毒性的重要方式,铜离子螯合剂可用于纳米铜的中毒治疗;纳米铜诱导的肝肾损伤可能与细胞氧化应激损伤、脂类代谢紊乱、能量代谢紊乱、线粒体结构和功能受损有关;尿液中柠檬酸、α-酮戊二酸降低、血清甘油三酯升高可作为纳米铜诱导肝肾损害的NMR标志物。代谢组学技术可作为纳米粒子在体毒性研究的重要手段,可快速评价机体生化成分变化,识别潜在的生物标志物;生物持久性不同是纳米铜在体内、外试验模型中的重要区别之一,应依据研究目的恰当选择体内、外试验方法。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 参考文献
• 第一章 纳米铜与微米铜的表征及毒性比较
• 第一节 纳米铜与微米铜的表征比较
• 材料与方法
• 结果
• 第二节 纳米铜和微米铜的一般毒性比较
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二章 纳米铜对体外培养HK-2 和HepG2 细胞毒性及其机制研究
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 1H NMR 技术研究纳米铜致大鼠内源性代谢物的变化'>第三章¹H NMR 技术研究纳米铜致大鼠内源性代谢物的变化
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 结论
• 致谢
• 攻读学位期间发表及撰写的主要学术论文目录