大量产小孢子核盘菌菌株生物学特性及其小孢子萌发特性研究

论文摘要

核盘菌（Sclerotiniasclerotiorum （Lib.） de Bary）是一种世界范围内广泛分布的、极具破坏性的植物病原真菌,由它引起的病害,如油菜菌核病、大豆白腐病等,每年给农业生产带来巨大损失。因此,对核盘菌进行深入研究,为病害防治提供理论依据紧迫而必要。真菌小孢子（microconidia）是一类能够萌发的分生孢子,或起受精作用的配子（gametes）。小孢子在核盘菌科真菌中广泛存在,大多作为不动精子起受精作用,也有一些种的小孢子具萌发和侵染潜力。核盘菌生活史中却通常很少产生小孢子,至今为止,仅有少量关于核盘菌小孢子的报道,但其特性和功能尚不明确。本研究对采自安徽省17个县的发病油菜植株上的1020份菌核进行了分离培养,共获得949株核盘菌菌株,并从中筛选出4株能产生大量小孢子,且菌落形态异常的核盘菌：HQ19、HQ32、HQ52、SX81。为进一步认识核盘菌生物学多样性及小孢子特性,本研究以与菌株HQ52分离自同一个菌核、却不能产生大量小孢子、菌落形态也正常的菌株HQ52-N-M和野生型核盘菌强毒力菌株Ep-1PNA367为对照,重点对上述4株核盘菌的生物学特性、致病力、产孢能力以及小孢子形态结构和萌发特性进行了研究,结果如下：1.与菌株HQ52-N-M和Ep-1PNA367相比,菌株HQ19、HQ32、HQ52和SX81的菌落形态异常,菌丝体在生长早期呈灰绿色,并形成大量的灰绿色粉末状气生菌丝,在生长后期（21d）形成大量黑色粉末状、颗粒状、或液滴状的产孢结构,很少形成菌核；生长速度显著减慢（p<0.01）；生物产量显著降低（p<0.01）；能大量生成小孢子；产菌核能力弱；菌丝亲和性表型异常。2.与菌株HQ52-N-M和Ep-1PNA367相比,上述4株核盘菌的菌丝尖端多弯曲回绕,菌丝分支角度较大,可能是导致菌落扩展速度变慢的原因；在菌落中间产生许多灰绿色,成簇,膨大的,类似于葡萄串状的气生菌丝,而且这些菌丝细胞在整个生长期内都不会彼此分离,但到生长后期颜色变褐。本研究首次发现核盘菌能够形成大量膨大的呈葡萄串状的气生菌丝簇结构。3.上述4株核盘菌均不能侵染健康的油菜叶片,但可以从伤口侵入油菜叶片,形成典型的黄褐色水渍状病斑。菌株SX81不能在洋葱表皮细胞上形成侵染垫,也不能侵入无伤口的洋葱内表皮细胞,但可以从有伤口的部位侵入洋葱内表皮细胞并扩展。接种针刺的油菜叶片2d后,菌株HQ32、HQ52和SX81所形成的病斑大小与强毒菌株Ep-1PNA367相比无显著差异（p>0.01）,仅HQ19的病斑大小明显低于Ep-1PNA367,菌株HQ52-N-M在油菜叶片上的病斑大小与Ep-1PNA367无显著差异（p>0.01）。4菌株能正常地产生和分解酸,因此其弱致病性可能与草酸的分泌无关。4.菌株HQ19、HQ32、HQ52和SX81在生长后期（21d左右）会产生大量直径约为2μm的圆形或卵形小孢子。小孢子在瓶状小梗上成串着生,而众多的瓶状小梗在略膨大的菌丝上单生或成簇聚生,这些产孢菌丝起源于从气生菌丝簇间伸出的比葡萄串状菌丝细胞要细得多的单根菌丝。与核盘菌属已报道的瓶状孢子梗形态不同的是,这些瓶状孢子梗顶端靠近着生小孢子的部位没有衣领状结构（collar）。这种小孢子表面不光滑,整个孢子周围有一层黏液样物质覆盖。另外,本研究首次发现小孢子具有脐部,为小孢子从瓶状孢子梗顶端被成串挤出时彼此间接触的部位。小孢子为单胞结构,单胞中的只有一个较大的肾形的细胞核、少量的细胞质和简单细胞器,这与前人的报道是类似的。5.20℃条件下,核盘菌小孢子在水琼脂、PDA、油菜浸汁培养基、胡萝卜浸汁培养基以及添加了牛肉浸膏、油菜汁、Zn2+的PDA上培养时都不能萌发；接种在寄主植物,如油菜和洋葱的叶片上时,未观察到萌发现象；将其置于4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、37℃、45℃下培养也不能够萌发；将其与菌株EP-1PNA367的菌丝混合后培养也不能促进孢子的萌发；经过0s、30s、60s、90s、120s、150s、180s、210s、240s等不同时间的紫外线照射也不能诱导小孢子的萌发。因此推测小孢子不是分生孢子,且不具备萌发能力。6.菌株SX81是4株核盘菌中产孢量最大的一株,其128个原生质体后代的菌落形态绝大多数类似于出发菌株,均能产小孢子和形成膨大的特异菌丝,并且其大量产生小孢子的特性不能通过菌丝融合或是通过分泌到细胞外的物质传递给带有潮霉素抗性标记的菌株Ep-lPNA367-hgy。上述结果表明,与强毒菌株Ep-1PNA367和HQ52-N-M相比,上述4株核盘菌具有产菌核能力弱、致病力弱、菌丝亲和性表型异常、能大量产生小孢子等特性,且菌落形态及产孢表型稳定。核盘菌小孢子为结构简单的单核细胞,在各种萌发诱导条件下均不能萌发。根据这些核盘菌菌株的生物学特性以及小孢子的亚显微结构和萌发特性,推测小孢子很可能不是分生孢子而是不动精子。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 核盘菌所致病害的概述
• 2 核盘菌研究进展
• 2.1 核盘菌的生物学特性
• 2.2 核盘菌的生活史与病害侵染循环
• 2.3 核盘菌的侵染过程与致病机理
• 3 小孢子研究进展
• 3.1 其它真菌小孢子的研究进展
• 3.2 核盘菌科小孢子的研究进展
• 3.3 孢子萌发特性概述
• 3.4 无性产孢机制及有性发育机制的研究进展
• 4 研究的目的和意义
• 第二章 核盘菌特异菌株的生物学特性
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 培养基
• 1.1.2 材料
• 1.1.3 酶、试剂盒及其它试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 核盘菌菌株的分离纯化、保存、活化和鉴定
• 1.2.2 核盘菌菌株间生物学特性的比较
• 1.2.3 小孢子的特性研究
• 1.2.4 数据处理
• 2 结果与分析
• 2.1 菌株的分离纯化和鉴定
• 2.1.1 菌株的分离纯化和保存
• 2.1.2 菌株的分子鉴定
• 2.2 菌株的生物学特性比较
• 2.2.1 菌株的菌落形态
• 2.2.2 菌株的菌丝形态
• 2.2.3 菌株的生长速度比较
• 2.2.4 菌株的生物产量测定
• 2.2.5 菌株的小孢子产量测定
• 2.2.6 菌株的菌核产量测定
• 2.2.7 菌株的菌丝融合群
• 2.2.8 菌株的致病力
• 2.2.9 菌株产酸和降解酸的能力
• 2.3 小孢子的特性研究
• 2.3.1 小孢子及孢子梗的形态
• 2.3.2 小孢子的亚显微结构
• 2.3.3 小孢子的核型
• 2.3.4 小孢子的萌发能力
• 3 结论与讨论
• 3.1 结论
• 3.2 讨论
• 第三章 菌株产小孢子能力的稳定性研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 培养基
• 1.1.2 菌株
• 1.2 方法
• 1.2.1 原生质体后代的生物学特性稳定性研究
• 1.2.2 产孢特性的传染性检测
• 2 结果与分析
• 2.1 原生质体再生菌株的生物学特性
• 2.2 菌株SX81产孢特性的传染性
• 3 结论与分析
• 3.1 结论
• 3.2 讨论
• 结论和展望
• 参考文献
• 致谢