S-腺苷甲硫氨酸高产菌株的选育与发酵工艺的优化

论文摘要

S腺苷甲硫氨酸（简称SAM）,是生物体内重要的中间代谢体,具有转甲基、转硫、转氨丙基等作用,是半胱氨酸、牛磺酸、谷光甘肽、辅酶A等重要物质的前体。能治疗神经紊乱、精神抑郁、关节炎等多种疾病,有着巨大的国际市场需求。本文对SAM产生菌进行了选育并开展发酵工艺研究,结果如下:通过对S-腺苷甲硫氨酸生产菌Saccharomyces cerevisiae B9菌株进行分离复壮,获得一株遗传性能较为稳定的菌株SAM-39#（1.765g/L）,以SAM-39#为出发菌株进行诱变育种,最后获得比出发菌株SAM-39#产量高69.89%的诱变株YZ-33,其SAM含量为3.001g/L,而紫外诱变、原生质体再生育种方法提高产量的效果不明显。通过比较发现:紫外线-氯化锂复合诱变和原生质体紫外复合诱变对SAM生产菌的诱变效果较好。以高产稳定的诱变株YZ-33为出发菌株,通过测定生长曲线,探索蜗牛酶的酶解浓度、时间、温度等因素对原生质体形成的影响,确定了制备原生质体的最佳条件为:种子液培养16h,0.1%β-巯基乙醇预处理10min,酶解浓度2.5%,酶解时间150min,用0.5mol/L的蔗糖作为渗稳剂。针对YZ-33菌株在不改变原有培养基组成成分的基础上,对其各组成成分进行了正交实验,找到最佳配比。得出最佳培养基配方为:蔗糖12%、氯化铵0.8%,酵母粉0.8%,硫酸镁0.005%,L-甲硫氨酸1.2%,磷酸二氢钾0.4%,磷酸氢二钾0.2%。另外,对菌株YZ-33摇瓶发酵过程中的pH值、生物量、SAM含量、蔗糖含量、NH4+等代谢参数进行测定,为SAM发酵工艺的建立提供了参考。还对补料工艺做了初步的研究,确定了补料工艺与最适宜补料方式。初步补料工艺为:L-Met补料终浓度0.8%,补料起始时间24h,蔗糖补料终浓度10%,补料时间48h;最适宜补料方式为:在24h加入0.6%L-Met、3%蔗糖,在48h按0.2%补加L-Met,蔗糖在48h和72h分别按2.5%补给。在此种补料条件下SAM的产量达到4.041g/L。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 SAM的理化性质
• 1.1.1 物理性质
• 1.1.2 化学性质
• 1.2 SAM的体内代谢
• 1.3 SAM的生物学功能
• 1.3.1 转甲基作用
• 1.3.2 转氨丙基作用
• 1.3.3 转硫作用
• 1.4 SAM的制备方法
• 1.4.1 酶促转化法
• 1.4.2 化学合成法
• 1.4.3 发酵法
• 1.5 SAM的失活机理
• 1.5.1 SAM分子内的亲核攻击
• 1.5.2 立体异构体消旋化导致的失活
• 1.5.3 水解导致的失活
• 1.5.4 其他因素
• 1.6 SAM的稳定性研究
• 1.6.1 SAM盐的合成及其稳定性
• 1.7 SAM的药理作用
• 1.7.1 抑郁症
• 1.7.2 肝病
• 1.7.3 关节炎
• 1.7.4 纤维性肌痛、偏头痛
• 1.7.5 神经紊乱
• 1.7.6 其它
• 1.8 SAM的临床应用
• 1.9 SAM产生菌的诱变育种
• 1.10 本实验研究的目的和意义
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 供试菌种
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 培养条件
• 2.3 分析方法
• 2.3.1 高效液相色谱法
• 2.3.2 SAM的筛选方法（HPLC）
• 2.3.3 SAM含量的测定
• 2.3.4 细胞浓度测定
• 2.3.5 pH测定
• 2.3.6 菌体生物量的测定
• 2.3.7 发酵液中蔗糖浓度的测定（DNS分光光度法）
• 4⁺的测定（纳氏试剂分光光度法）'>2.3.8 发酵液中NH₄⁺的测定（纳氏试剂分光光度法）
• 2.4 诱变处理方法
• 2.4.1 斜面菌种制备
• 2.4.2 菌悬液的制备
• 2.4.3 原生质体的制备
• 2.4.4 原生质体的再生
• 2.5 高产菌株的选育
• 2.5.1 出发菌株的复壮
• 2.5.2 原生质体制备与再生单因素试验
• 2.5.3 紫外线诱变处理
• 2.5.4 紫外氯化锂复合诱变方法
• 2.5.5 原生质体紫外诱变
• 2.5.6 原生质体再生
• 2.6 稳定性试验
• 18（3⁷）正交试验'>2.7 发酵培养基L₁₈（3⁷）正交试验
• 2.8 发酵代谢曲线的测定
• 2.9 补料工艺的确定
• 2.9.1 L-Met补加浓度的确定
• 2.9.2 蔗糖补加浓度的确定
• 2.9.3 L-Met加入时间的确定
• 2.9.4 蔗糖的加入时间的确定
• 2.9.5 L-Met和蔗糖的加入方式的确定
• 2.10 数据处理方法
• 3 结果与分析
• 3.1 原始菌种的复壮
• 3.2 UL-34菌株的原生质体制备与再生
• 3.2.1 SAM产生菌的菌体生长曲线
• 3.3 SAM产生菌SAM-39菌株诱变育种
• 3.3.1 紫外线诱变
• 3.3.2 紫外线一氯化锂复合诱变
• 3.3.3 原生质体紫外线诱变
• 3.3.4 原生质体再生引起的UL-34变异
• 3.4 YZ-33遗传稳定性的考察
• 3.5 小结
• 3.6 发酵工艺优化
• 18（3⁷）正交试验结果'>3.6.1 发酵培养基L₁₈（3⁷）正交试验结果
• 3.6.2 发酵代谢曲线的测定
• 3.6.3 补料工艺的确定
• 3.7 小结
• 4 讨论
• 参考文献
• 致谢