瑞氏木霉纤维素二糖水解酶CBHI噬菌体展示系统的构建

论文摘要

瑞氏木霉（Trichoderma reesei）纤维二糖水解酶Ⅰ（cellobiohydrolase Ⅰ）是目前研究的最为广泛的一种外切葡聚糖酶。其研究主要集中在两个方面,一方面是进一步阐释CBHI与结晶纤维素的作用机制,另一方面是对酶性质、特点、稳定性和催化活性等进行改造以满足生物工程应用的需要。CBHI在噬菌体展示系统中的展示,为进一步研究其作用机制和CBHI的定向进化提供了一个良好的研究平台。 本论文使用基因重组技术,分别构建了重组噬菌体表达质粒pCANTAB 5E—cbh1及pCANTAB 5E—cd,在噬菌体表面对纤维素外切酶CBHI全酶及其催化结构域（CD）进行了表达展示。 根据目的基因cbh1的cDNA序列设计两对引物,分别扩增cbh1全序列及其催化结构域序列cd,使之上游带SfiⅠ酶切位点,下游带NotⅠ酶切位点,以质粒pUCmT-cbh1为模板,进行PCR扩增反应,得到了长度分别为1.55kb和1.3kb的目的片段;将所得的DNA片段经NotⅠ和SfiⅠ双酶切后分别与噬菌粒载体pCANTAB 5E进行连接,然后导入大肠杆菌TGI中,用Ampr筛选获得了阳性克隆,经双酶切鉴定,验证了构建的重组噬菌粒为pCANTAB 5E-cbh1和pCANTAB5E-cd。 用帮助噬菌体M13K07侵染验证后的TGI转化子（pCANTAB 5E-cbh1）,制备带有外源基因cbh1的重组噬菌体,酶联免疫吸附剂测定（ELISA）表明重组噬菌体对滤纸有明显的特异性吸附,说明展示后的CBHI的吸附特性没有改变。以pNPC为底物测定重组噬菌体的外切酶酶活,发现在重组噬菌体上表达的CBHI可水解pNPC底物,酶活为2.625×10-14IU/CBHI分子,证明展示后的CBHI催化特性没有改变。将带有外源基因cbh1的重组噬菌体侵染大肠杆菌HB2151,通过IPTG诱导表达出可溶性的外源蛋白CBHI。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示,HB2151转导子与原始HB2151菌株所表达的蛋白在分子量为54kDa处出现明

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 纤维素的微生物降解与纤维素酶
• 1.1.1 纤维素的性质和结构
• 1.1.2 纤维素酶降解微生物的多样性
• 1.1.3 纤维素酶的性质及酶系的作用机制
• 1.1.4 纤维素酶的应用前景
• 1.2 瑞氏木霉纤维素外切葡聚糖酶 CBHI结构性质及作用机理的研究
• 1.3 噬菌体展示系统
• 1.3.1 噬菌体展示技术的原理及研究进展
• 1.3.2 噬菌体展示在酶学研究中的应用和酶的定向进化
• 1.3.3 单链丝状噬菌体 M13展示系统
• 1.4 本论文的研究目的和意义
• 第二章 纤维素外切葡聚糖酶 CBHI全酶及其催化结构域的噬菌体表面展示
• 2.1 导言
• 2.2 实验材料
• 2.3 实验方法
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 目的基因cbbl PCR扩增引物设计
• 2.4.2 重组质粒pCABTAB 5E-cbh1和pCANTAB 5E-cd的构建
• 2.4.3 目的基因在噬菌体中的表达展示及产物分析鉴定
• 第三章 纤维素外切葡聚糖酶 CBHI全酶可溶性蛋白的性质研究
• 3.1 导言
• 3.2 实验材料
• 3.3 实验方法
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 噬菌体展示 CBHI全酶分子量的测定
• 3.4.2 外切葡聚糖酶测定结果
• 总结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表文章
• 学位论文评阅及答辩情况表