锯缘青蟹副溶血性孤菌分离鉴定及抗TLH单克隆抗体的制备

论文摘要

锯缘青蟹（Scylla serrata）为十足目,短尾次目,梭子蟹科,青蟹属,是我国重要的食用蟹。近年来,我国的东南沿海海域发生严重病害,造成锯缘青蟹的大量死亡,使我国的水产养殖业蒙受巨大的经济损失。副溶血性弧菌是主要致病菌之一。本试验从病蟹中通过划线培养,挑取优势菌落,经青蟹攻毒感染试验,分离出一株致病菌S,并通过菌落形态、生理生化特征等方面,初步将S菌鉴定为副溶血性弧菌。从该菌中克隆不耐热性溶血毒素基因（tlh基因）,并将含有tlh基因的pET32a（+）质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）,在LB培养基中,通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达出TLH蛋白。以纯化的TLH免疫小白鼠,经过间接ELISA法检测血清的效价,通过细胞融合方法获得了一株能稳定分泌抗TLH单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为:CH-112。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 1 文献综述
• 1.1 锯缘青蟹的生物学特性
• 1.2 锯缘青蟹常见病害
• 1.2.1 弧菌病
• 1.2.2 其他常见的细菌性疾病
• 1.3 锯缘青蟹的病害检测研究
• 1.3.1 锯缘青蟹的病原体检测研究现状
• 1.3.2 锯缘青蟹常见致病菌──副溶血性弧菌（VP）的快速检测
• 1.4 微生物的分离与鉴定
• 1.4.1 病原菌分离的理论基础
• 1.4.2 微生物鉴定技术
• 1.5 副溶血性弧菌的特异基因──tlh
• 1.6 单克隆抗体
• 1.6.1 单克隆抗体的基本概念
• 1.6.2 单克隆抗体的特点
• 1.6.3 单克隆抗体的制备
• 1.6.4 单克隆抗体的应用
• 1.7 本试验的目的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 样品
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 患病青蟹采集
• 2.2.2 副溶血性弧菌的分离纯化
• 2.2.3 青蟹的攻毒感染试验
• 2.2.4 副溶血性弧菌的鉴定
• 2.2.5 副溶血性弧菌tlh基因克隆与表达
• 2.2.6 单克隆抗体的制备
• 3 结果与分析
• 3.1 病蟹观察
• 3.2 副溶血性弧菌的分离纯化
• 3.3 青蟹的攻毒感染试验
• 3.4 副溶血性弧菌的鉴定
• 3.4.1 显微镜下形态鉴定
• 3.4.2 生理生化学鉴定
• 3.5 副溶血性弧菌tlh基因的克隆与纯化
• 3.5.1 细菌基因组DNA的提取
• 3.5.2 tlh基因的PCR扩增结果
• 3.5.3 重组表达载体的鉴定
• 3.5.4 TLH的表达与纯化
• 3.6 单克隆抗体的制备
• 3.6.1 免疫动物的抗血清效价
• 3.6.2 细胞融合
• 3.6.3 筛选
• 4 讨论
• 4.1 副溶血性弧菌的分离与鉴定
• 4.2 重组表达载体的构建
• 4.3 TLH蛋白的诱导表达
• 4.4 TLH的纯度
• 4.5 杂交瘤细胞的检测
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢