论文摘要
鸡球虫病是一种严重危害鸡生长发育的寄生原虫病,是危害养禽业发展的重大疾病之一。其传统的化学药物防治办法还存在诸多问题,因而促使本病的防治由药物转向疫苗。实践证明,激发宿主细胞免疫反应来防治鸡球虫病是更有效的途径之一。核酸疫苗（nucleic acid vaccine）是一种新的生物技术疫苗,具有可靠的安全性、高温稳定性、能诱导机体产生全面的免疫应答等优点。巨型艾美耳球虫（E.maxima）是诱发鸡球虫病的4种常见球虫之一,危害巨大。EmTFP250是巨型艾美耳球虫无性生殖阶段抗原,该基因是TRAP（thrombospondin-related anonymous protein）（TSP相关蛋白）家族的一员,属于微线蛋白。基因序列全长7990bp,开放阅读框7083bp,预测其编码246kDa的蛋白。本研究根据EmTFP250基因抗原表位的分布情况,将巨型艾美耳球虫基因EmTFP250分为八段,分别命名为Em1（231-1187）、Em2（1124-1988）、Em3（1850-3113）、Em4（3071-4214）、Em5（4133-49 64）、Em6（4916-5882）、Em7（5783-6341）和Em8（6242-7310）。分别设计引物,进行分段克隆,然后克隆入pcDNA4.0真核表达载体,用于免疫雏鸡,检测其对巨型艾美耳球虫感染鸡的保护作用。以纯化的巨型艾美耳球虫孢子化卵囊为材料提取总RNA,然后采用RT-PCR技术分别克隆出EmTFP250基因的各个片段,即Em1（231-1187）、Em2（1124-1988）、Em3（1850-3113）、Em4（3071-4214）、Em5（4133-4964）、Em6（4916-5882）、Em7（5783-6341）和Em8（6242-7310）。测序结果表明Em1、Em2、Em3、Em4、Em5、Em6、Em7和Em8分别含980、881、1297、1149、810、1014、579和1092个碱基,且分别编码326、293、432、383、270、338、193和364个氨基酸。将克隆得到的八段基因分别与国外发表的EmTFP250基因全序列进行分段比较,核苷酸序列同源性和氨基酸同源性均为99%以上。利用DNA重组技术,分别构建pcDNA4.0-Em1、pcDNA4.0-Em2、pcDNA4.0-Em3、pcDNA4.0-Em4、pcDNA4.0-Em5、pcDNA4.0-Em6、pcDNA4.0-Em7、pcDNA4.0-Em8真核表达质粒。酶切鉴定正确后,分别用重组质粒免疫14日龄雏鸡,1周后取注射部位、非注射部位肌肉组织,用RT-PCR方法检测保护性抗原的转录情况。结果表明Em1、Em2、Em3、Em4、Em5、Em6、Em7和Em8基因均能在注射部位肌肉里成功转录。pcDNA4.0空质粒、重组质粒pcDNA4.0-Em1、pcDNA4.0-Em2、pcDNA4.0-Em3、pcDNA4.0-Em4、pcDNA4.0-Em5、pcDNA4.0-Em6、pcDNA4.0-Em7、pcDNA4.0-Em8经腿部肌肉注射分别于14、21日龄两次免疫雏鸡,并设感染非免疫和非感染非免疫对照组。28日龄经口接种新鲜E.maxima孢子化卵囊,一周后宰杀全部实验动物,分别对小肠病变计分、每克粪便中卵囊数（Oocysts per gramfeces,简称OPG）、增重和抗球虫指数（ACI）四个指标进行统计,检测各重组质粒保护力的大小。结果表明,所构建的真核表达质粒pcDNA4.0-Em1、pcDNA4.0-Em2、pcDNA4.0-Em3、pcDNA4.0-Em4、pcDNA4.0-Em5、pcDNA4.0-Em6、pcDNA4.0-Em7、pcDNA4.0-Em8对感染巨型艾美耳球虫鸡均有不同程度的保护效果,其中以重组质粒pcDNA4.0-Em1、pcDNA4.0-Em3、pcDNA4.0-Em6、pcDNA4.0-Em8组保护效果最好,有可能作为侯选的巨型艾美耳球虫DNA疫苗。